136株临床分离鲍曼不动杆菌产16SrRNA甲基化酶检测及其同源性研究.pdfVIP

中围感染与化疗杂志2011青年优秀论文集 297 136株临床分离鲍曼不动杆菌产16SrRNA 甲基化酶检测及其同源性研究 高燕渝， 吕晓菊， 俞汝佳， 宗志勇 (四川大学华西医院感染性疾病中心，四川成都 610041； 人类疾病生物治疗国家重点实验室，四川成都 610041) 摘要： 目的 了解我院临床分离鲍曼不动杆菌含16SrRNA甲基化酶基因的现状；并初步探讨该基因的传播途径。 方法对临床分离的阿米卡星高度耐药菌株，用PCR方法检测16SrRNA甲基化酶基因，并进行序列比对；用ERIC- PCR进行菌株同源性分析，用接合试验验证耐药基因水平传播途径。结果136株临床分离菌中高耐氨基糖苷类76 动杆菌I全部产armA菌结合试验阳性。结论我院鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类药物高度耐药与16SrRNA甲基化酶 有关。16S甲基化酶编码基因既可通过克隆传播，也可通过质粒水平传播。 关键词：鲍曼不动杆菌；16SrRNA甲基化酶基因；耐药性 鲍曼不动杆菌是重要的条件致病菌。氨基糖苷类药物是治疗肠杆菌科细菌感染的重要抗生素。 一直以来，氨基糖苷类药物的耐药机制主要包括2种：①细菌外膜蛋白的通透性改变或细胞内膜转运 异常，使药物在菌体内的蓄积减少而引起耐药；②产生氨基糖苷类钝化酶而导致耐药[1]。2003年以 来，Doi等[21从高度耐药的细菌中发现了16SrRNA甲基化修饰酶，这种酶与细菌对氨基糖苷类药物 的高度耐药有关。 我国目前主要分离到的16SrRNA甲基化酶类型为口惭诅型和RmtB。本实验拟采用表型筛选方法 检出临床分离的非重复鲍曼不动杆菌株中高耐氨基糖苷类抗生素菌株，再用分子生物学技术进行印 证‘3l。 材料与方法 一、菌株收集和鉴定 我们收集了2007年到2009年我院住院病人送检的痰、脑脊液、脓液、咽拭子、中段尿、血液、留置 导管提取物等中分离的非重复鲍曼不动杆菌共136株。细菌鉴定采用MICROSCAN全自动细菌鉴 定仪，部分采用梅里埃手工鉴定试剂条。质控菌株为大肠埃希菌ATCC27853。 二、抗菌药物敏感性测定 1 024 rag／L)共136株。 三、基因检测 (一)细菌处理采用煮沸法提取细菌总DNA。即：挑取新鲜过夜纯培养单个菌落数个，水浴箱 000 煮沸10min，13 r／rain离心1mm，丢弃沉淀。 buffer 4 (二)PCR扩增反应体系为：10×PCR 5肛L，dNTPpL，前后引物各1弘L，氯化镁2．5 30s，52℃ min，循环温度为94。C 弘L，taq酶0．2弘L，用水定容到50弘L。引物见表1。预变性94℃5 40s，72℃1 min。产物用试剂盒 min，30个循环，72℃10min。产物用1％琼脂糖凝胶100伏电泳45 基金项目：本实验接受国家自然科学基金项目1309000523资助。 通信作者：宗志勇，E-mail：zongzhiyong(孕gmail．corn． 298 中国感染与化疗杂志2011青年优秀论文集 进行纯化，纯化后送测序。 表1 检测16SrRNA甲基化酶基因以及ERICPCR所用的引物 四、ERIC-PCR分型 5 40 S，52。C S，72℃1min，30个循环，72℃10 方法预变性94。Cmin，循环温度为94℃30 min。电泳 结果按不