粟酒裂殖酵母SnoRNA snR90基因缺失株的筛选鉴定.pdfVIP

维普资讯 2007年 6月 韶关学院学报 ·自然科学 Jun．2007 第 28卷 第 6期 JournalofShao~uanUniversity ·NaturalScience V01．28 No．6 粟酒裂殖酵母 SnoRNAsnR90基因缺失株的筛选鉴定 陈燕飞 (韶关学院英东生物工程学院，广东韶关 512005) 摘要：sRR90是在粟酒裂殖酵母中发现的一种单基 因编码的boxH／ACA类 snoRNA．在利用遗传手段在粟酒裂殖酵 母基 因组 中敲除了snR90基因后 ，通过选择性培养基、PCR、Northern杂交这一系列方法筛选鉴定出sRR90基因缺 失株 、该基因缺失株 ~ rR90的成功构建对 sRR90功能的分析很有的意义． 关键词 ：核仁小分子 RNA；粟酒裂殖酵母 ；snR90；同源重组 ；聚合酶链式反应 ；Northern杂交 中图分类号：Q752 文献标识码：A 文章编号：1007—5348(20o7)06—0084—04 在粟酒裂殖酵母(Schiwzsaccharomycespombe)全序列测序中，首次注释了33个核仁小分子 RNA(smallnu— cleolarRNA，snoRNA)基因 J．之后，又有 l4个 snoRNA的基因序列和22个非编码RNA序列被发现．近年，通 过实验 RNA组学方法获得了43种新的非编码 RNA (smallnon—massagerRNA，snmRNA)，其 中20种 snmRNA 具有 boxH／ACAsnoRNA的序列和结构元件 ，为新的boxH／ACAsnoRNA，另外23种 snmRNA为无 已知RNA类 型的保守序列和结构元件 ．同时，还发现了44种 boxC／DsnoRNA的基因序列 。．这些研究成果无疑为在 S． pombe中进行 snoRNA的有关研究提供了有益的参考 ．随着多个物种中新种 RNA(以snoRNA居多)的发现和 鉴定，当今 RNA组学研究的重心已逐渐从种类鉴定转 向各种 RNA功能的分析研究． SnR90是新鉴定的一种 S．pombe特有的boxH／ACAsnoRNA分子，它在核糖体 25S的成熟过程中起着负 责指导pre—rRNA转录后假尿嘧啶化修饰的作用 ．根据文献报道，在 已被鉴定的新种 snoRNA里，snR90是其 中很特别的一个 4【]．SnR90由单拷贝基因编码 ，位于粟酒裂殖酵母 I号染色体上蛋 白质基因的间隔区，其间 隔区的大小为6OO至3000nt．它的编码基因位于一个非编码 RNA基因的外显子中，该非编码 RNA基因的内 含子中还存在一个 boxC／D类 snoRNA(snR80)基因 ，这是一种很特别的基因组织形式．在基因5’端上游有 典型的TATAbox元件 ，表明它是独立转录的．该基因具有典型的boxH／ACA类反义 snoRNA的结构元件和 双发夹铰链配对区，即在其序列的中部有一个bonn(ATAGAA)它们的3’端含有一个保守的三核苷酸序列 “ATA”的结构，而且是位于RNA分子 3’端的第 3个核苷酸的上游 ．在借助同源重组的实验技术利用酵母遗 传分析系统对 S．pombe中的snR90基因进行敲除(geneknock—out)，构建基因缺失株后，为了更准确地对 snPO0的功能进行分析，对该基因缺失株的筛选及鉴定显得格外重要 ． 1 材料与方法 待筛选的基因缺失株2xsnR90的构建主要分为三步：(1)获得 snR90编码基因所在片段及两侧旁翼序列 的克隆；(2)构建上游序列A—Kant一下游序列 B的重组质粒；(3)重组DNA(pTZI8一A—Karl一B)的转化．此 过程主要是通过借助上游序列A的上下游引物(AF／AR)和下游序列 B(BF／BR)引导的一系列同源重组方法 完成 ． 1．1 选择性培养基初选 将同源重组后获得的粟酒裂殖酵母接人普通 YPD培养基 (非选择性)中培养 18h后，用NaC1溶液将培 收稿 日期：2007—03—06 基金项 目：国家自然科学基金重点资助项 目 作者简介：陈燕飞 (1980一)，女，广东韶关人，韶关学院英东生物工程学院教师，硕士，主要从事分子生物学研究