第四节 转基因技术.pptVIP

第四节 转基因技术 一、概念 通过一定方法把人工重组的外源DNA导入受体动物的基因组中或把受体基因组中的一段DNA切除，从而使受体动物的遗传信息发生人为改变，并且这种改变能遗传给后代的一门生物技术。 二、哺乳动物转基因技术的意义 （一）在基础生物学中 （二）在基础医学研究中 （三）在畜牧业中 三、哺乳动物转基因技术的研究概况 美国科学家Jaenisch等人在1974年最早把猿猴病毒害40（SV40）注入小鼠囊胚腔中，得到部分体组织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠。 1980年，Gordon等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。 1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠2倍的“超级鼠”。 1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的β-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了抗胰蛋白酶。 四、哺乳动物转基因技术的程序 (一)目标基因克隆和体外重组 　　目标基因是准备导入受体的DNA序列，目前获得目标基因的途径有三条：　　1.人工合成　　它是用DNA合成小片段碱基序列，一般不超过100个碱基。　　2.互补DNA（cDNA）的克隆 　　通过提取组织中的mRNA，用反转录酶合成cDNA，建立cDNA文库，再克隆目标蛋白的cDNA。　　 3.DNA克隆 　　首先建立动物的DNA文库，再通过基因克隆技术获得编码目标蛋白的基因，这是获得目标基因最常用的方法。　　目标基因被克隆以后需与表达载体相连结，形成一个独立表达的调控单元，再通过扩增和纯化，使DNA达到一定浓度就可用于基因导入。 (二)外源基因的导入 外源基因的导入方法主要有五种： 1.显微注射法　　它借助显微操作仪，把DNA分子直接注入到受精卵的原核中，通过胚胎DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中。它是哺乳动物最常见的转基因方法，效果稳定，导入时不受DNA分子量的限制。但是，这种方法操作复杂，转基因效率低。 2.反转录病毒感染体 　　反转录病毒是双链RNA病毒，它侵染细胞后可通过自身的反转录酶以RNA为模板在寄主细胞染色体中反转录成DNA。在利用病毒载体转基因时，首先要对病毒基因组进行改造，将外源基因插入到病毒基因组致病区，然后用此病毒感染胚胎细胞，即可对胚胎细胞进行遗传转化。如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因组中，可获得转基因动物，在第一次卵裂之后整合，会产生嵌合体，其第二代可能出现转基因动物。 3.胚胎干细胞法 　　 这种方法首先是用外源基因转化胚胎干细胞，通过筛选，把阳性细胞注入受体动物的囊胚中，生产嵌合体动物，当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获得转基因动物。这种方法可对阳性细胞进行选择，实现外源DNA的定点整合。缺点是第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长。 4.精子载体法 　　　它是利用哺乳动物的获能精子能结合外源DNA的特性，通过受精过程把外源DNA导入受精卵，获得转基因动物。它的优点是方法简单，转基因效率高。缺点是效果不稳定，外源DNA分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能。 5.细胞核移植法 　　 这种方法是随着哺乳动物体细胞核移植技术的发展而建立的。首先用外源DNA对培养的体细胞或胚胎干细胞进行转染，然后选择阳性细胞作供体，通过细胞核移植，获得基因动物。这种方法是非常理想的转基因手段，因为它可与基因打靶技术结合，实现外源基因的定点整合，消除外源DNA随机整合带来的负作用。这种方法的转基因效率可达100%，大大降低转基因家畜的生产成本。但是，这种方法的广泛应用还依赖于体细胞克隆技术的发展，目前还难以实现。 （三）外源ＤＮＡ整合、转录及表达的分子检测 　　1.外源基因的整合检测 　　它是检测动物基因组中是否携带外源DNA。常用的方法是由用目标基因的一段序列作引物，用聚合酶链式反应仪（PCR仪），扩增目标DNA，再通过电泳初步检测是否含有目标基因。然后，用Souehern杂交检测PCR阳性个体是否含有目标基因，如果出现阳性，就可以断定为转基因阳性动物。 2. 外源基因的转录检测 　　它是用Northern杂交法对转基因动物某一组织的mRNA进行分析检测，出现阳性表明外源基因具有转录活性。3.外源基因的表达检测　　它是检测转基因动物组织中是否含有目标基因编码的外源蛋白质，常用的方法有酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法。 (