一株耐碱Mn-SOD高产细菌的分离、基因克隆及序列分析.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（５）：１０１～１０６ 一株耐碱ＭｎＳＯＤ高产细菌的分离、 基因克隆及序列分析 １ １ ２ １ １ 孟　鑫 　阚国仕 　刘剑利 　王晓丹 　陈红漫 （１沈阳农业大学生物科学技术学院　沈阳　１１０１６１　２辽宁大学生命科学系　沈阳　１１００３６） 摘要　首次从长白山温泉土中筛选得到了一株高产耐碱 ＳＯＤ的细菌，通过抑制剂试验确定了该 菌所产ＳＯＤ类型为ＭｎＳＯＤ。通过形态特征、生理生化特征及 １６ＳｒＤＮＡ基因序列分析，与芽孢杆 菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＭＯ６同源性高达１００％，与地衣芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ同源性为９９％。根据 地衣芽孢杆菌ＭｎＳＯＤ序列，并结合ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的多种细菌ＭｎＳＯＤ基因保守区，分别设 计引物，ＰＣＲ扩增获得６００ｂｐ的ＭｎＳＯＤ全基因序列和４３０ｂｐ的核心片段，克隆ｓｏｄＡ全基因序 列，构建重组质粒ｐＭＤ１８ＳＯＤ。 关键词　锰超氧化物歧化酶　基因克隆　序列分析 中图分类号　Ｑ７８５ 　　超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ，ＥＣ． ＳＯＤ基因，并在不同宿主中得以表达，但对耐碱芽孢杆 １．１５．１．１）是生物体防御氧损伤的一种十分重要的金 菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）的ＭｎＳＯＤ基因序列国内外尚未见报 ［１］ 道。因此，本研究以长白山温泉土中筛选得到的一株 属酶 ，广泛存在于动物、植物和微生物体内，根据其 活性位点结合的金属离子的不同，分为 Ｃｕ，ＺｎＳＯＤ、 高产耐碱ＭｎＳＯＤ的细菌为出发菌株，通过ＰＣＲ技术 ［２，３］ 克隆了耐碱ｓｏｄＡ基因，并对其氨基酸序列进行分析，为 ＦｅＳＯＤ和ＮｉＳＯＤ 。由于编码ＭｎＳＯＤ的基因定位 于多种肿瘤染色体畸变的频发部位，而人体线粒体中 进一步在大肠杆菌中诱导表达奠定了理论基础，以期 又以ＭｎＳＯＤ为主，因此 ＭｎＳＯＤ与其它种类 ＳＯＤ相 获得高产耐碱 ＭｎＳＯＤ的基因工程菌，增加新的ＳＯＤ 比，在防衰老、抗辐射损伤和治疗炎症等方面应用前景 基因资源，应用于大规模的工业化生产。 ［４］ 更为广阔，并且还是潜在的新型肿瘤抑制剂 ，被誉为 １　材料与方法 “２１世纪人体健康的卫士”。 　　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．１１０２是我室首次从长白山温泉土中筛 １．１　材　料 选的一株高产耐碱ＭｎＳＯＤ的细菌，通过形态特征、生 １．１．１　土样　长白山温泉边土壤 ｒ 理生化特征及 １６ＳｒＤＮＡ基因序列分析，与 Ｂｕｃｈｈｅｉｍ， １．１．２　质粒与菌株　ｐＭＤ１８Ｔ，克隆载体（Ａｐ），购自 ＴａＫａＲａ公司。菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ 为本实验室保存。 Ｊ．Ａ．等在２００４年从美国Ｏｋｌａｈｏｍａ火山盐碱土中筛选 α 出的一系列耐热耐碱细菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．的同源性达到 １．１．３　主要试剂　ＴａｑＤＮＡ聚合酶，限制性内切酶 ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ公司）；５溴４氯３吲哚Ｄ ９９％以上，该菌及其所产酶均具有较强的耐碱性，因此 β 可利用耐碱性质进行分离纯化，克服了传统复杂的纯 半乳糖苷（Ｘｇａｌ），胶回收