单细胞凝胶电泳在猪精子质量检测上的应用.docVIP

单细胞凝胶电泳在猪精子质量检测上的应用 李兆华* 张树敏 张志斌 赵晓东 金鑫 李娜 吉林省农业科学院畜牧分院单细胞凝胶电泳是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂的方法，与传统DNA损伤检测方法相比，SCGE具有简便、快速、经济、灵敏，并无需放射性标记、所需细胞少等优点，适合于体内、外不同类型实验和各种类型细胞DNA损伤的研究。该方法广泛应用于DNA修复、遗传毒理、环境监测和细胞凋亡的研究。本文对彗星试验的发展、原理、方法及其在在猪精子质量检测上的应用等方面进行了综述。关键词：猪精子 单细胞电泳 DNA损伤单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresisassay，SCGE）又称彗星试验（comet assay），是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂的方法。从理论上讲，该方法适用于所有有核细胞，能够灵敏的检测单链和双链DNA的断裂，在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤，监测环境污染物对机体的遗传损害，研究毒物致癌机制等有广泛的应用价值。与传统DNA损伤检测方法相比，SCGE具有简便、快速、经济、灵敏，并无需放射性标记、所需细胞少等优点，适合于体内、外不同类型实验和各种类型细胞DNA损伤的研究。因此，SCGE技术在近几年取得了很大的发展和广泛的应用。SCGE的发展 1978年，Rydberg和Johanson[1]首次定量检测了单细胞DNA损伤，将细胞包埋于琼脂糖，在碱性条件下使DNA解螺旋，中和后用吖啶橙染色，用光度计测定绿光（表明双链损伤）与红光（表明单链损伤）强度，用二者之比来测定损伤程度，但由于处理过程要求十分严格，故该技术未被广泛应用。1984年，Ostling和Johanson[2]发明了微凝胶电泳技术，将细胞包埋于琼脂糖凝胶中，铺于载玻片上，在去污剂和高盐溶液中溶解，然后在中性条件下电泳，溴乙啶染色后，用荧光光度计测定。Olive[3]对上述方法进行了改进，采用了较严格的溶解条件，使中性SCGE成为检测DNA双链断裂（DSBs）的灵敏方法。但该方法不能检测DNA单链断裂（SSBs）。1988年，Singh[4]等提出在碱性条件下进行单细胞凝胶电泳，检测SSBs和碱性不稳定位点，完善了DNA变性和单链DNA的迁移，使该技术在测定DNA损伤与修复中广泛应用。1997年，Santos[5]等首次将SCGE技术与DNA荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridiza—tion，FISH）结合起来，为SCGE技术的应用开辟了新的途径。2001年，Nadin[6]等建立了SCGE银染法，进一步提高了损伤DNA分析的灵敏度。单细胞凝胶电泳用于检测有核细胞DNA损伤的技术，可在单个细胞水平上检测DNA损伤和修复。其基本原理是：在细胞裂解液的作用下，有核细胞的生物膜破坏，使细胞内的DNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯核DNA仍附着在剩余的核骨架上而留在原位。DNA解螺旋后进行电泳，如细胞未受损伤，则核DNA断片较少，片段较大，电泳时DNA因其分子质量大而停留在核基质中，经荧光染色后呈圆形的荧光团无拖尾现象；若细胞受损，DNA断片较多，在碱性条件下DNA解螺旋变为单链，电泳时因DNA分子量小可以进入凝胶中，向阳极伸展，荧光显微镜下呈一个亮的头部和尾部，形似彗星，故又称彗星实验。DNA受损越严重，产生的断片越多并且片段越小，电泳时迁移的DNA量也就越大，迁移距离越长，荧光显微镜下可观察到尾长增加、尾部荧光强度增强，通过测定迁移部份的光密度和迁移长度就可定量测定单个细胞的DNA损伤程度。目前，已建立了多种SCGE实验方法，但都是在Ostling和Singh等的中性和碱性SCGE的基础上改进形成的，其基本原理相同。根据Singh等[4]1988年设计的方法，在60℃下，将100μl正常熔点琼脂糖在无Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）浇注到磨砂的显微镜载玻片上，盖上盖玻片，约3分钟待琼脂糖固化后去除盖玻片；在37℃下，将68μl低熔点琼脂糖与16μl（约2000个细胞）的受检细胞相混后，滴于上一层正常熔点琼脂糖上，再将80μl低熔点琼脂糖作为第3层，并加盖玻片，置4℃冰箱5分钟使之固化。然后去掉盖玻片，置载玻片于冰冻的裂解液中2小时，以去除细胞蛋白，再把载玻片置碱性电泳液中约1小时，使DNA链在电泳前解离。在4℃、200mA、25V下电泳30min，取出载玻片，在pH7.5、0.4mol/L三酸盐中浸泡15分钟以中和过多的碱，加溴化乙锭（EB）50mg/L，5分钟后用蒸馏水浸洗，然后加盖玻片待检。荧光显微镜下，每片随机观察约100个细胞，依据DNA 在“彗星细胞”尾部的量对DNA损伤程度进行分级[7]：0级，无损伤，损伤低于5％ ；A级，轻度损伤