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Lecture-13 细胞生物学实验方法与原理细胞生物学实验方法与原理 第十三讲 细胞增殖和细胞凋亡 检测技术 江维 12‐13‐2012 Contact Email ：ustcjw@ustc.edu.cn SchoolSchool ofof LifeLife SciencesSciences, USTCUSTC 细胞增殖检测技术细胞增殖检测技术 1. 直接计数 3 2. 胸腺嘧啶核苷(( H‐TdR))渗入法 3. MTT检测法 4. 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 (CFSE)检测法 5. 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法 66. CCK8CCK8 7. Ki67 1.直接计数直接计数 利用计数板或计数仪得出细胞的数目利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对数目进行比较然后对数目进行比较。 优点： 简单简单：：不需要特定的试剂和仪器不需要特定的试剂和仪器 准确 缺点： 不适合样品数量多的情况不适合样品数量多的情况 不适合评估特定的亚群 33 22.胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 ((HH-TdR)TdR)渗入法渗入法 胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 （（TdRTdR））是是DNADNA特有的碱基特有的碱基，也是也是DNADNA合成的必需合成的必需 3 3 物质。用同位素 H标记TdR即 H-TdR作为DNA合成的前体能掺入 DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细 胞胞DNADNA的代谢及细胞增殖情况的代谢及细胞增殖情况。。 66 ①① 无菌取细胞无菌取细胞，培养液调整细胞浓度至培养液调整细胞浓度至11 ××1010 //mll ② 将细胞悬液加入96孔细胞培养板内，每孔100ul,分对照组和 实验组（实验组加入相应的刺激原，对照组加入等体积的 培养基培养基）），置于细胞培养箱内孵育置于细胞培养箱内孵育。 3 ③ 在终止培养前16‐24小时每孔加入 H-TdR 20ul ④ 将每孔培养物分别吸收于直径24mm的玻璃纤维滤纸上，抽 气过滤并用蒸馏水充分洗涤气过滤并用蒸馏水充分洗涤。。 ⑤ 将滤纸片放在烘箱内烘干。 ⑥ 将滤纸片浸于加了10ml脂溶性闪烁液的闪烁杯中，置于- 液体闪烁计数液体闪烁计数器中测定每个样品的每分钟脉冲数中测定每个样品的每分钟脉冲数 （cppm值值） 3H3H-TdRTdR掺入掺入法法：：结果判定结果判定  以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpmcpm 。。取各管测定读数取各管测定读数 的平均值，即为0.1ml细胞的脉冲数。再按淋巴细胞计数结果， 6 校正成每百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/10 淋巴细胞）。  也可以刺激指数（SI ）表示试验结果，试验管脉冲数与对照 管脉冲数之比，即为刺激指数。 试验孔A 570nm 均值 SISI 对对照孔A 570nm 均均值值 优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。 缺点缺点：但需但需一定设备条件定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题同时还存在放射性核素污染问题。 3.3. 55-溴脱氧尿嘧