化学修饰木瓜蛋白酶酶学性质的研究.pdfVIP

第24卷第6期 分 子 催 化 Vo1．24．No．6 2010年 12月 JOURNALOFMOLECULARCATALYSIS(CHINA) Dec． 2010 文章编号 ：1001—3555(2010)06-0529-08 化学修饰木瓜蛋 白酶的酶学性质研究 熊亚红 ，吴巧儿，苏健鸿 (华南农业大学 理学院生物材料研究所 ，广东 广州 510642) 摘 要 ：采用邻苯二甲酸酐 (PA)对木瓜蛋 白酶进行 了化学修饰 ，通过三硝基苯磺酸法、紫外光谱 、荧光光谱及 FT—IR光谱对修饰效果进行了初步表征，采用动力学方法考察了pH和温度对修饰酶水解活性和稳定性的影响， 并计算了一系列动力学和热力学参数．实验结果表明：PA对木瓜蛋 白酶的平均氨基修饰度为43％，未对酶的活 性基团一SH发生修饰，修饰酶较原酶的紫外吸收峰和最大荧光发射峰均发生蓝移，紫外吸收强度降低、荧光强度 增大；PA修饰未改变木瓜蛋 白酶的最适反应温度，但将其最适反应 pH由7．0提高到8．5，且酶活力也提高了约 20％；PA修饰有效提高了酶的催化水解效率和酶与底物的亲和力，如40cc、最适pH条件下修饰酶的转化数k (3．03S )和亲和力 l／ (1．70s·L·g )均较原酶的(2．28s～、1．15s·L·g )高，修饰酶催化水解反应的 活化能Ea(25．4kJ·mol )较原酶的(29．3kJ·mol )低 ；PA修饰还明显提高了酶的pH稳定性和热稳定性，半 衰期 t延长，酶分子的热变性活化能E 由77．0kJ·otol 提高到94．5kJ·mol～．可见 PA化学修饰法是一种 有效改善木瓜蛋 白酶的催化性质和稳定性的方法． 关 键 词：木瓜蛋 白酶；化学修饰；稳定性 ；动力学；热力学参数 中图分类号：Q55；0643．32 文献标识码 ：A 木瓜蛋 白酶 (papain，EC3．4．22．2)又称木瓜 不同程度的提高，研究结果表明酶化学修饰是改善 酶，其分子量为23000Da，等电点为9．5，由212个 酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措 氨基酸残基组成的单肽链形成 ，分子 中含有 11个 施 ．由于赖氨酸 (1ysine，lys)残基末端的 ￡-NH 赖氨酸 (1ysine，Lys)残基 ．木瓜蛋 白酶在未成 具有较强的亲核性 ，能够与许多亲电试剂在温和的 熟的番木瓜果 (Caricapapaya)表皮的白色乳汁中含 条件下发生反应，有利于修饰过程 中保持酶的活 量丰富 ，是一种含巯基 (一SH)的肽链 内切酶，它 性、减少酶活损失，因此，e—NH：成为化学修饰的 具有广泛的底物专一性 、良好的热稳定性及价格便 首选官能团．邻苯二 甲酸酐 (phthalicanhydride， 宜等优点，广泛应用于食品、医药 、饲料 、纺织及 PA)是 lys的一种专一性修饰剂 ，能够有效地改善 染料等工业．由于天然木瓜蛋 白酶作为一种天然酶 天然酶的多种性能 “．由于 lys残基不是木瓜蛋 剂在一些非温和条件下 (如高温、高酸碱性、重金 白酶的活性中心部分，因此可 以采用PA来对木瓜 属离子等)其结构容易受到破坏而导致活性降低、 蛋白酶进行化学修饰 ’． 甚至完全丧失，而人们对木瓜蛋 白酶的催化活性 、 酶催化反应的一些动力学和热力学参数对于研 稳定性 、底物选择性及 pH适应范围等各种性能提 究酶的催化反应是非常必要的．动力学参数可提供 出更高的要求，因此对木瓜蛋 白酶进行分子结构改 一 些酶催化反应机理方面的信息，而热力学参数可 造以改善和提高其酶学性能，已经越来越引起人们 提供一些酶变性机理方面的信息．人们通常采用微 的重视 ． 量量热法研究