影响SPF鸡微生物检测和种蛋孵化的常见因素.docVIP

影响SPF鸡微生物检测和鸡胚利用的常见因素分析 李丽① 黄兵② 张世栋① （①山东昊泰实验动物繁育有限公司 ②山东省农业科学院家禽研究所） 随着现在整个中国市场无特定病原（SPF）鸡饲养规模的扩大，饲养量的逐渐增加，其微生物检测是我们最关注的问题。尤其是SPF鸡及鸡蛋的质量是各生物制品厂及科研单位最关注的，它直接关系着各种生物制品（如疫苗，诊断制剂，血清等）的质量。种蛋利用的前期孵化也非常重要，它直接影响产品的质量和收获量。现在各生物制品厂及SPF种蛋供方均有各自的实验室，但是在检测结果和前期孵化上却存在差异，下面我们针对检测和孵化方面存在的一些问题，做一简单的概述，以供大家共同探讨。 一．在微生物检测方面存在的因素 现在SPF鸡必检病原微生物有19种，常用的检测方法包括血清平板凝集实验（SPA），琼脂扩散试验（AGP），血凝抑制试验（HI），酶联免疫吸附试验（ELISA），临床观察（CO）。下面针对以上检测方法在临床检测上存在的一些问题，我们简单分析一下： 1 血清平板凝集实验：在做本实验前首先要将抗原及阴阳性血清恢复至室温，待检血清若在当日取出后，来不及检测，不能冷冻保存，应放2-8℃保存，且待检血清样品最好56℃水浴灭活30分钟，以破坏补体及血凝抑制因子，降低非特异性反应。 2 琼脂扩散试验：只要诊断试剂在有效期内，质量合格，一般不存在什么问题。 3 血凝抑制试验：参照SPF鸡微生物检测标准（GB/T17999.1-2008）将血清56℃水浴灭活30分钟后进行检测。现在多数实验室的检测结果均达到2-3个HI滴度，这与血清样本质量有关，特别是血浆纤维蛋白的存在或血脂过高引起的非特异反应，针对这一原因有文章报道，可利用血清的间接免疫荧光试验（IFA）,血涂片法（BSL）加以区别，故从统计学抽样考虑，一般以4log2作为临界点，大于4log2判为阳性，小于4log2判为阴性。 4 酶联免疫吸附试验：随着对种蛋质量要求的提高，ELISA应用更加广泛，应用此方法，简单迅速，准确性也较高。故现在各生物制品厂及SPF种蛋供方多采用此方法进行检测。ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括样品处理，试剂配制，加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责。但是应用此方法检测在不同实验室所检出的值却有所不同，那么影响ELISA值的因素主要有哪些？我们通过临床试验大约概括为以下几点，供大家参考。 4.1 血清标本溶血时释放出大量具有酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，造成假阳性。卵黄中亦有干扰辣根过氧化物酶的物质。 4.2 血液未开始凝固或凝固不完全时就强行离心，此时分离的血清中仍残留部分纤维蛋白原，进行ELISA测定时，容易造成假阳性结果。 4.3 样本在冰箱保存时间过长易导致血清IgG聚合，使试剂本底加深，一般2-8℃冷藏3天内完成。-20℃保存勿反复冻融。 4.4 检测试剂盒批次间差异，同一块板的孔间亦有差异（CV），一般在8%以内。 4.5 操作温度最好严格按试剂盒说明进行。水质亦很关键，最好用去离子水。显色反应终止后应立刻比色。 4.6 采食前后血液中的各种蛋白酶浓度可能不一样，会引发检测值有差异，但不会很大。 4.7 仪器质控 4.7.1 移液器：ELISA加样量小（5-100ul） 5