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第五章 核酸类药物 第一节 概述 （二）提取与纯化 （三）含量测定 二、DNA的制备 三、核苷酸、核苷及碱基的制备 光合磷酸化法制备ATP的工艺流程 ATP的药理作用与临床应用 * * 核酸是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。 98%分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体。 主要分布于细胞质（90%），剩余10%位于细胞核。 (deoxyribonucleic acid, DNA) (ribonucleic acid, RNA) 脱氧核糖核酸 核糖核酸 携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。 参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。 核酸 碱基 戊糖 核苷 磷酸 核苷酸 核酸类药物是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以及碱基的统称。除了天然存在的碱基、核苷、核苷酸外，它们的类似物、衍生物或这些类似物、衍生物的聚合物也属于核酸药物。 一、RNA的制备 （一）材料的选择与预处理 制备RNA的材料要选择含核酸量丰富的组织。 RNA的含量和细胞的活跃程度有关，在蛋白质合成旺盛的细胞中，其核酸的含量也相应地较高。 第二节 核酸类药物的一般制备方法 组织匀浆 沉淀物（DNA、蛋白质等） 上清液（RNA等） 残留物（DNA等） 酸提取液（RNA） 碱处理 酸处理 残留物 脂溶性物质 有机溶剂处理 残留物 酸溶性小分子 冷酸处理 1. 酸处理法 将经酸和有机溶剂处理后的残留物用1mol/L的过氯酸液于4℃下处理18 h，从中抽提出RNA，沉淀部分再用0.5mol/L的过氯酸液70 ℃下处理20 min提取DNA。 此法的缺点是有些材料的DNA在冷过氯酸抽提时被少量提取，从而使RNA部分中混有少量的DNA。 2. 碱处理法 将残留物用1mol/L的NaOH溶液于37 ℃处理过夜，则RNA被碱解为碱溶性核苷酸，DNA不溶解。加入过氯酸或三氯乙酸使溶液酸化，至酸浓度为5%-10%,此时，RNA的分解产物溶解在上清液中，DNA等则被沉淀下来。此法的优点是RNA和DNA分开得较为彻底，缺点是RNA中还含有其他含磷化合物，如磷肽，磷酸肌醇等。 1. 提取 （1）乙醇沉淀法 （2）去污剂处理法 （3）酚法 2. 纯化 （1）密度梯度离心法 （2）柱色谱法 （3）凝胶电泳法 定磷法 （1）核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷； （2）制定定磷标准曲线； （3）测定回收率和样品总磷量。 (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 ? MoO3（钼蓝） 定糖法 Vit ? C RNA中的戊核糖可在盐酸的水解作用下游离出来，进一步形成糠醛，然后与地衣酚反应，反应物程鲜绿色，在670nm有最大吸收峰。 材料的选择与处理 2. 提取与纯化 3. 含量测定 （1）定磷法 同RNA （2）定糖法 又称二苯胺法，在酸性溶液中，将DNA与二苯胺共热，形成蓝色化合物，该化合物在595nm有最大吸收。当DNA浓度在20-200ug/mL时，光吸收度与DNA浓度呈正比。 （一）制备方法 1. 直接提取法 2. 水解法 （1）酶水解法 （2）碱水解法 （3）酸水解法 3. 化学合成法 4. 酶合成法 5. 微生物发酵法 5′-AMP [ 溶解，混合 ] Na2HPO4，Tris，PMS 肌激酶，ATP（引子） 混合液 反应液 ATP粗制品 上清液 滤液 ATP成品 ATP沉淀 洗脱液（含ATP） 吸附物 流出液 [ 光合 ] 叶绿体 pH3,1-1.5h [ 沉淀 ] 三氯乙酸 10℃以下 [ 提取 ] 乙醇 10℃ 4-5h [ 干燥 ] 乙醇，乙醚 减压 [ 去阳离子 ] 732树脂 pH6→1→2 [ 除热源、沉淀 ] 硅藻土、乙醇 [ 去杂质 ] 蒸馏水、硅藻土 [ 洗脱 ] NaCl溶液 pH3.8 [ 吸附 ] NaOH，717树脂 pH6.5-7 在生物体内，ATP广泛参与各种生化过程，除参与核酸形成外，主要起着供应能量和磷酸基团的作用。 ATP除了作为危重病人抢救的辅助药物外，还可对慢性肝炎、肝硬化、肾炎、心肌炎、冠状动脉硬化、进行性肌肉萎缩、再生障碍性贫血、脑血管意外后遗症、中心性血管痉挛性视网膜脉络膜炎、风湿性关节炎、耳聋、耳鸣等有一定疗效。 *