PTSD大鼠杏仁核神经元凋亡及TMP酶变化研究.pdfVIP

PTSD 大鼠杏仁核神经元凋亡及TMP 酶变化的研究 1 丁金兰，韩芳，石玉秀* 中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，沈阳 (110001) E-mail: shiyuxiu@163.com 摘 要：目的：研究创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder ，PTSD ）大鼠杏仁核神经 元细胞凋亡及三偏磷酸酶（Thiamine Monophosphatase TMP ）活性的变化。方法：成年健康 雄性Wister 大鼠50 只，随机分为SPS 模型的 1d、4d 、7d、14d 组及正常对照组。应用Annexin V-FITC/ PI 双标记流式细胞技术分析PTSD 大鼠杏仁核神经元细胞凋亡及定量检测；利用透 射电镜观察杏仁核神经元超微结构改变；利用酶组织化学方法检测杏仁核神经元TMP 酶活 性的表达变化。结果：SPS 刺激后：杏仁核神经元细胞凋亡率显著增加，TMP 酶活性明显 比正常对照组增强，均于第4d 达高峰。7d 和14d 凋亡细胞逐渐减少、TMP 酶活性减弱。结 论：PTSD 杏仁核神经元发生细胞凋亡，凋亡率增加的同时TMP 酶活性相应增强，提示 TMP 酶参与PTSD 大鼠杏仁核神经元凋亡产物的吞噬。 关键词：PTSD；杏仁核；细胞凋亡；流式细胞术；TMP 酶 中图分类号：R322．81 1. 引言 创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder ，PTSD ）是对创伤等严重应激因素的一种 异常精神反应，是应激疾病中最为典型的一种[1] ，于严重创伤应激急性期,在中枢神经系统 （CNS)皮质边缘区,特别是杏仁核、海马和下丘脑等处短期内神经可塑性改变, 提示这些脑 区可能为 CNS 应激应答敏感区。研究已表明，PTSD 大鼠海马萎缩[2]，海马神经元发生凋 亡[3]，那么杏仁核作为边缘系统中重要的皮质下核团，主司恐惧和焦虑，发生PTSD 时杏仁 核是否也发生细胞凋亡呢？并且杏仁核TMP 酶活性的表达及其改变可能影响其功能状态。 因此本实验从这两方面切入，采用流式细胞仪、透射电镜检测PTSD 大鼠杏仁核神经元是否 出现神经细胞凋亡；酶组织化学技术观察PTSD 杏仁核神经元TMP 酶的相应变化，有望进 一步揭示PTSD 发病机理。 2. 材料和方法 2.1 实验动物及分组 成年健康雄性Wistar大鼠50只（中国医科大学实验动物中心提供），体重150-180g，常 规饲养于环境温度22 ℃和8：00～2O ：00定时光照的房间，食物和水可自由摄取。随机分为 5组，即SPS的1d、4d 、7d、14d组及正常对照组，每组10只。 2.2 PTSD 样大鼠模型的建立 采用日本文部省召开的“PTSD 的基础和临床的研究进展”会议确定的 PTSD 模型—SPS 刺激。SPS 刺激是指将大鼠连续进行下述步骤处理： 大鼠禁锢2 小时后，立即强迫游泳20min （水深40cm，水温25 ℃）。经过15min 的恢 复，乙醚麻醉至意识丧失，在笼子中不再经任何刺激正常饲养分别于1d、4d 、7d、14d 取材。 2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 1 本课题得到国家自然科学基金项目）、辽宁省教育厅科技攻关项目（05L491 ）的资助。 *通信联系人。 - 1 - 分别取正常及经过SPS刺激后1d、4d 、7d 、14d各组大鼠断头，开颅取出杏仁核，置于 冰冻PBS 中，用小剪刀剪成小碎块，0.25%胰酶0.3ml置于37℃恒温水浴消化30min ，加入 DMEM(含10%小牛血清)3ml终止消化。经200 目筛网过滤转入离心管中，800rpm,离心8min， 弃上清，加入PBS液3ml,摇匀，再次800rpm,离心8min，弃上清，加入PBS液2ml,摇匀。 将上述置备好的单细胞悬液调整浓度为5×105 6