RNAi技术及应用.docVIP

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RNAI技术及其应用 提要: RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。RNAi 的作用机制. RNAi 的第一步是,dsRNA 在内切核酸酶(一种具有RNase 样活性的核酸酶称为Dicer.) 作用下加工裂解形成21~25 nt 的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA果蝇中RNase III 样核酸酶Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在Dicer 同类物.近年来研究发现,干扰性小RNA(siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类特殊双链RNA(dsRNA) 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基. 此外,每条单链的3′端均有2~3 个突出的非配对的碱基细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 获得dsRNA. 主要有三种途径: 一:细胞内产生的mRNA在RNA聚合酶的作用下,依一条单链的RNA合成一条双链RNA;二:体外人工合成,原理类似于上;三:有一些长的RNA具有反向互补序列,它会自己和自己互补,产生一个茎环结构,这个结构很容易被核酸内切酶识别,但是核算内切酶只降解单链部分,互补的双链RNA被留下来。 在线虫( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌RNAi 的第二步是, 由siRNA 中的反义链指导形成同源RNA 链搜索活性siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象. RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征.最新的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用. 较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体; 随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与. 此外,ATP 使siRNA 5′端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子 引自 Gregory J.Hannon(2002) Nature,418,244-251 MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的,随后组装进RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表miRNA参与各种各样的调节途径,包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。 miRNA 与siRNA 的区别: (1) miRNA是单链的,而siRNA则是双链的; (2) miRNA参与正常情况下生长发育基因调控,而siRNA不参与动物体的正常生长,只有在病毒或其它dsR

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