赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究.pdfVIP

维普资讯 四川 大 学 学 报 (医 学 版 ) 2oo8 JSichuanUniv (MedSc Edi) … u；39(3)…：347…—35VO Univ SciEd · 论 著 · 赖型钩端螺旋体 017株外膜蛋白LipL32基 因 重组质粒的构建及其细胞毒性的研究 黄 毕，鲍 朗△，钟 琪，商正玲，张会东，王中平 四川大学华西基础医学与法医学院 感染免疫研究室(成都 610041) 【摘要】 目的 构建赖型钩端螺旋体 (钩体)017株外膜蛋 白LipL32基因的重组质粒 ，并研究其细胞毒性 。方 法 从钩体 017株全基 因组 中用 PCR方法扩增 出 目的基 因，双酶切构建重组质粒 ，转化大肠杆菌，诱导表达 LipL32蛋 白，将表达 的 目的蛋 白免疫新西兰大 白兔，制备多克隆抗体 ，WesternBlotting鉴定其免疫原性 。将 目的蛋 白纯化、复性后作用于 ECV304细胞 ，通过检测细胞的乳酸脱氢酶 (LDH)、NO释放量研究其细胞毒性 。结果 扩 增出816bp的LipL32基因，重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经 IPTG诱导表达的 融合蛋 白相对分子质量约 52×1O。，主要 以包涵体的形式表达，经免疫动物制备得到多克隆抗体，ELISA检测效价 达 1：32000．WesternBlotting显示在 目的蛋 白位置处有特异性阳性条带。经过 LipL32蛋 白作用 的ECV304细胞 LDH、N0释放量和对照组 比较有 明显升高 。结论 成功构建 LipL32基因重组质粒 ，该质粒能在大肠杆菌 中表达 ， 表达的 目的蛋白对细胞有一定的毒性效应 。 【关键词】 钩端螺旋体 外膜 蛋白 LipL32 表达 细胞毒性 【中图分类号】 R377．5 Recombinant Plasmid Constructed and Cytotoxieity Studied for Outer M embrane Protein LipL32 Gene of LeptospiraStrain017 HUANG Bi，BAO Lang ，ZHONG Qi．SHANG Zheng-ling，ZHANG Hui—dong． WANG Zhong—ping． ResearchUnitofInfectionandImmunity，WestChinaSchoolof PreclinicalandForensic M edicine，SichuanUniversity，Chengdu 610041，China [Abstract] Objective ToconstructtherecombinantplasmidcontainingtheoutermembraneproteinLipL32 gene ofLeptospira strain 017 and to study on thecytotoxicity oftheexpression protein．M ethods By the polymerasechainreaction (PCR)，theLipL32genewasamplifiedfrom Leptospirastrain 017genomeandcloned intopET32a(+)withenzymedigestion，thenusedtotransform E．coliJM109．Afterinducedwith IPTG，the targetprotein wasexpressedand used to immunizeNew zealandwhiterabbit．W esternBlottingidentified the immunogenicityoftheexpressedprotein．ThenthepurifiedandrenaturedproteinwasactedonECV304cellsoas