一种简单、经济的植物RNA抽提方法ASimpleEconomicalMethodfortheIsolationofPlantRNA.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)20(4):28一301998 ·实 验 技 洲阵与 方 法 · 一种简单、经济的植物RNA抽提方法① 孟 玲 谭德勇 王焕效 吕朝晖 王晓燕 周 翔 云（南大学生物系．昆明650091) ASimpleEconomicalMethodfortheIsolationofPlantRNA MENGLing TANDeyong WANGHuanxiao LVZhaohuiWANGXiaoyan ZHOUXiang (DepartmentofBiology,YunnanUniversity,Kunming650091) RNA的抽提是分子生物学的基本操作之一，是进行基因表达分析及基因克隆等分子生物学研究的基础， RNA抽提的质量关系到以后工作的成败。由于RNA酶活性强，故要得到无降解RNA一直是一个令人头疼的 问题，尤其是植物RNA。植物细胞具有坚硬的细胞壁，细胞内有较大的液泡，含较多的多糖、多酚及一些不明 次生代谢物。植物RNA酶含量丰富而mRNA含量较低，而且植物缺少富含单一mRNA的组织和器官 ”〔，故 植物RNA的提取更显得困难。 从Cox(1968)，首次利用蛋白质强变性剂盐酸肌从富含RNA酶的植物材料中抽提出无降解的RNA后， 肌盐逐渐取代酚抽提法被广泛用于RNA的抽提．以后肛盐法经多次改进至Chomczynski的酸性肛盐一酚：氯仿 一步法时基本趋于成熟3,〔4,5)。本方法在Chomczynski的酸性肌盐一酚：氯仿一步法的基础上进行适当改进，使 之更适合于植物RNA的抽提。特别是在植物组织破碎上试用了柠檬酸组织捣碎法，避免了操作麻烦的液氮研 磨，取得了满意的实验效果，现将此方法报道如下． 1材 料 与 方 法 1.1试剂与实验用品的处理 柠檬酸匀浆缓冲液 1.5％柠檬酸，2%fl-琉基乙醇，50mmol/LEDTA,pH3.5, 裂解缓冲液 8mol/L盐酸肌，0.1%SDS.20mmol/L醋酸钠，pH5.8. 酸性酚溶液 重蒸酚用DEPC处理水饱和。 抓仿溶液 氯仿一异戊醇49：1, 2mo1/L醋酸钠溶液 pH5.4，用0.1％DEPC处理。 75％乙醇 用DEPC处理水配制。 20mmol/LEDTA (pH8.0)，用0.1%DEPC处理。 DEPC处理的消毒三蒸水。 实验用品的处理 除实验第一、第二步骤外，其余操作所接触的实验用品均需 1801C烘烤6小时 （玻璃用 品）或0.1%DEPC水浸泡，于37℃温育12小时并经高压灭菌塑（料制品）后才能使用。以上用品也可用氯仿漂 ①国家自然科学基金资助的项目。 4期 孟 玲等：一种简单、经济的植物RNA抽提方法 29 洗．待氯仿挥发后高压灭菌使用。 1.2实验方法 1.2.1取1一5g新鲜植物材料用蒸馏水洗净并用吸水纸吸干表面水份后，剪碎，加150ml柠檬酸匀浆缓冲液冰（预 冷）于ZK高速组织捣碎机 江（苏省盐城市龙 冈医疗机械厂生产）内，10OOOr/min高速匀浆5次，每次5秒。然 后，一层沙布过滤，滤液经3000xg离心10分钟 最（好采用低温或冷冻离心机）后，尽量除去上清液，得到细 胞沉淀。如果植物材料幼嫩，如嫩根、嫩叶、芽等以及一些保护组织不发达的双子叶植物，且材料数量不多，可 不采用上述步骤，而直接在玻璃匀浆器或研钵内加适量裂解缓冲液直接匀浆至细胞彻底破碎。 1.2.2在沉淀中加人8-lOml裂解缓冲液，充分混匀。此时，溶液应变为粘稠状 （细胞膜破裂DNA释放），并 加人lml2mol/L醋酸钠溶液 p（H5.4)，混匀、盖上盖子，上下用力摇动10秒 打（断DNA长链）。然后，迅 速加人等体积的酸性酚 ：氯仿溶液，并盖紧盖子，快速有力、上下剧烈摇动 巧秒，迅速置于冰上，并连同冰一 起放人4℃冰箱内、准确冰浴15分钟。然后，于4C10000xg离心15分钟。小心吸出上清液，转移至另一清 洁的50ml离心管内。重复酸性酚 ：氯仿抽提 1一2次至界面清晰。 1.2.3将上清液转移至清洁