黑曲霉F246phyA基因克隆及新型表达载体构建.pdfVIP

维普资讯 2004年 8月 重 庆 大 学 学 报 Aug．2004 第27卷第8期 JournalofChongqingUniversity Vol_27 No．8 文章编号：1000—582X(2004)08—0060—05 黑曲霉F246的phyA基因克隆及其新型表达载体构建 霍 丹 群 ，范 守城 ，张 云 茹 ，侯 长 军 ，范 首 君2 (1．重庆大学 生物工程学院教育部生物力学与组织工程重点实验室，重庆 400030； 2．重庆市养猪科学研究院重庆市重点实验室，重庆 402460) 摘 要：利用PCR法直接从 自行筛选、鉴定的黑曲霉F246中扩增出phyA基因，再将PCR产物重组 于乳酸茵表达载体pMG36e，构建phyA基因的新型表达载体pMG36e—p 。以黑曲霉F246基因组为 模板，对phyA基因的成熟肽(1347bp)进行PCR扩增。再将PCR产物克隆入pMD18T质粒，经DNA测 序和氨基酸分析、鉴定正确后，亚克隆入乳酸茵表达质粒pMG36e，构建工程茵LactobacillusMG1363一 pMG36e-phyA。重组乳酸茵表达载体pMG36e—phyA的构建，可望获得大量、高活性植酸酶，为研制多功 能微生态制剂奠定基础。 关键词：植酸酶；克隆；表达载体；乳酸茵 中图分类号：Q94 文献标识码 ：A 植酸酶(Phytase，phyA)是催化植酸及其盐类物 控制血清胆固醇水平；4)改善乳糖代谢；5)诱导体内 质水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称。它是一种糖蛋 特异性及非特异性免疫；6)抗肿瘤活性。因此，乳酸 白，分子量在50～60kDa范围内，广泛存在于微生物、 菌逐渐受到重视并广泛用作基因的表达系统 。现 麦芽、种子中…。近年来，随着饲料工业、畜牧业的发 已报道，利用乳酸菌获得了医用的疫苗、抗原、酶、必需 展及生物技术的完善，植酸酶在以下几个方面表现出 氨基酸等的高效表达。此外，乳酸菌表达系统还有安 巨大的应用前景：1)作为新型单 胃动物饲料添加剂 。 全性好、遗传背景清楚、无内毒素、表达效率高、蛋白质 通过对畜禽饲养证明，植酸酶可解除植酸对微量元素 一 般正规折叠、表达蛋 白不用纯化等优点，因而成为当 的螯合作用，提高饲料中磷的利用率，促进单胃动物的 今基因工程四大表达系统之一 。 生长发育。2)缓解我国磷资源匮乏，保护生态环境。 本研究旨在将黑曲霉F246的phya基因与pMG36e 植酸酶可代替饲料原料中添加的无机磷 (磷酸氢钙)， 连接，构建乳酸菌表达载体pMG36e—phyA，以期得到 同时将使畜禽粪便中磷的排出量减少40％～75％，大 高活性植酸酶以及开发出含植酸酶的多功能微生态制 大减轻江河、水域等环境的磷污染。3)作为工业催化 剂。目前，国内还没有用 pMG36e质粒表达植酸酶的 剂，实现植酸盐工业化生产肌醇或肌醇磷酸盐。其中 研究报道。 三磷酸肌醇产物具有消除体内自由基、抗血小板凝聚 1 材料和方法 以及消炎等作用。4)开发高级保健品和植酸酶菌肥。 利用食品级植酸酶处理粮食，提高其营养价值，开发功 1．1 材料 能性食品；循环利用土壤中有机磷和谷物淀粉加工处 1．1．1 质粒、茵株 理后的废弃物开发肥料等 J。 黑曲霉(AspergiUus厅 )F246为重庆市养猪科学 乳酸菌栖居、繁殖于肠道等部位的粘膜表面，在维 研究院分离鉴定的产植酸酶菌株。 持体内微生态平衡和健康的同时，还具有以下特殊功 E．coliJM109，为重庆大学分子生物实验室保存， 能：1)防止肠道感染；2)增强某些食