草鱼血清IgM蛋白纯化及抗血清制备.pdfVIP

第34卷 第1期 水 生 生 物 学 报 VoI．34，NO．1 2010年 1月 ACTAHYDROB10LOGICA SINICA Jan．． 20 10 DOI：10．3724／SP．J．1035．2010．00164 草鱼血清 IgM 蛋白的纯化及抗血清的制备 丁炜东 曹丽萍 曹哲明 (中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室，无锡 214081) 摘要：采用盐析法 、重组蛋白A(HiTraprProteinASepharose)亲和层析法分离纯化草鱼血清中的IgM，并通过 SDS—PAGE及Western—blot技术对纯化蛋白的部分特性进行分析比较并制备兔抗IgM抗血清。结果表明：33％ 硫酸铵溶液可以沉淀血清中大部分蛋 白，但电泳条带仍较多，其中含有 78kD和 28kD的条带，因此仅可作 为免疫球蛋白粗提 的方法 ；而 rProteinA 亲和层析法所提蛋 白则仅有上述重链 (78kD)和轻链 (28kD)。 Western—blot显示，鼠抗人 Ig抗体可与78kD及 28kD条带发生发应。rProteinA亲和法提纯蛋白的纯度较高， 但含量较低，条带较淡，仅可作为实验室小量提纯草鱼IgM 的有效方法。将提纯的蛋白免疫实验兔后可制得 效价高达 1：25600的兔抗鱼 IgM血清，并测得血清蛋白总量和IgM含量分别为 25．87mg和4．5mg，IgM 占 血清蛋白总量的 17．39％。本实验所采用的蛋白A亲和层析法提取草鱼血清 IgM 可以方便 、快捷地获得高纯 度的产物，适合在实验室中纯化鱼类 IgM。同时本研究所制备的兔抗草鱼 IgM 血清也为今后的相关研究工 作打下基础。 关键词：草鱼；蛋 白A亲和层析法；免疫球蛋白；兔抗鱼 IgM血清；酶联免疫吸附分析 中图分类号：Q816 文献标识码：A 文章编号：1000—3207(2010)01—0164．06 抗体是在宿主对抗原刺激的免疫应答过程 中， 和石斑鱼 、斑马鱼 1等。 由淋巴细胞产生的一类能特异性识别并中和相应抗 草鱼 (Cienoyharyngodonidellus)是我国内陆水 原的具有免疫功能的球蛋白。作为体液免疫系统 中 域主养的优质鱼类，20世纪60年代以来其产量占我 重要的免疫效应分子，免疫球蛋 白是有颌类脊椎动 国淡水鱼产量的 20％。近年来，亲鱼选择的盲 目性 物所特有的[1]。免疫球蛋白由重链和轻链组成，根据 及人工近亲繁殖已导致主要经济性状退化 、生长速 重链(Heavychain，H链)恒定区化学结构的不同，相 度减慢、性成熟个体变小、抗逆力下降等 1【问题，环 应的免疫球蛋白被划分为多种类型，分别为免疫球 境污染致使其天然种群数量明显下降和种质资源破 蛋 白 M(IgM)、免疫球蛋白 D(IgD)、免疫球蛋 白 坏。对淡水草鱼，国内学者 】『卅曾研究过它的免疫 A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)$11免疫球蛋 白G(IgG)。 应答，推断草鱼免疫应答中可能有一种含有较多二 而 目前硬骨鱼类中已经分离到的免疫球蛋 白包括 硫键的类似于 IgM 某些特性的大分子蛋 白质，但没 IgM、IgD、IgZ和 IgT]。IgM是一类存在于所有有 有对其性质作进一步的研究。本文主要利用蛋白A 颌类脊椎动物中的抗体，其重链从软骨鱼类到哺乳 亲和层析的方法对草鱼血液 中免疫球蛋 白进行提取 类 中都具有较高的保守性 】。近年来国内外对鱼类 纯化，并通过 SDS—PAGE及 Western．blot技术对纯 IgM进行了广泛研究，如斑点叉尾鲴l4】、海鲢I5】、大 化蛋白的部分特性进行分析比较，并用纯化的草鱼 西洋鳕 刚、大西洋鲑 、虹鳟 引、鲤 1、鳜 m1、牙鲆 IgM 免疫实