苏云金芽孢杆菌Cry1Ca7蛋白定点突变对甜菜夜蛾杀虫活性的影响.pdfVIP

维普资讯 微生物学报ActaMicrobiologicaSinica 48(6)：733-738；4June2008 ISSN0001—6209；CN11-1995／Q hRp：mournals．im．ac．ca 苏云金芽孢杆菌CrylCa7蛋白定点突变对 甜菜夜蛾杀虫活性的影响 任羽，刘华梅，宋福平，黄大畴，张杰 (中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室北京 100094) (中国农业科学院生物技术研究所 ，北京 100081) 摘要：苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7对重要的农业害虫甜菜夜蛾具有较高毒力。【目的】本 文的研究 目的是通过定点突变的方法获得毒力发生改变的毒蛋白，为下一步研究工作提供有价值的 实验材料。【方法】利用重叠引物PCR技术对 crylCa7基因进行定点突变，获得了 10种突变基因， 通过生物活性测定的方法确定了各突变基因表达产物对甜菜夜蛾的杀虫活性。【结果】活性降低的突 变毒蛋 白有 G 。S，T D，T21R，N51s， GGT*40，N06R，W 76F，R E和 R’。G，其中，位于 DomainII内的突变的活性依次是 GGT 。N。RW 76F；位于DomainIII内的突变 R ER 。G， 二者的活性较 CrylCa7也有明显降低 ；只有位于结构域 I中的 RHG，产生了活性提高的突变毒蛋 白，其毒性较 Cry1Ca7提高了6倍 ，而同样位于 DomainI内的突变 T DT RGn。SN S，尤 其是 T D活性完全丧失。研究结果表明，在结构域 I中的突变更容易产生活性提高的突变蛋白， 而结构域 Ⅱ和Ⅲ较难获得毒力提高的突变蛋白。【结论】本项研究所获得的这些活性发生不同变化的 蛋白为揭示 Cry蛋白的杀虫机理提供了基础材料 ，而活性提高的诱变基因及其表达产物将可作为新 的杀虫资源，用于抗虫遗传工程菌和转基因植物的构建。 关键词 ：苏云金芽孢杆菌；杀虫晶体蛋 白；定点突变 ；crylCa7基因；甜菜夜蛾 中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0001—6209(2008)06—0733—06 苏云金芽孢杆菌 (Bacillusthuringiensis，简称 位点，提高毒力和扩大其杀虫谱 ，直接用于害虫的防 Bt)在产芽孢期形成的、对多种害虫具有毒性的晶体 治已成为可能。 蛋 白，是由3个不同的结构域构成的，结构域 I位于 Cry蛋白结构域 I是一个螺旋束的结构，相对灵 毒性多肽的N端 ，由7个0成【 ，主要参与在昆虫中肠 活，在这一部分进行突变 ，更容易产生活性提高的蛋 上皮细胞形成孔道。结构域 Ⅱ主要是B一棱柱结构，它 白，例如 ：Kumar对 CrylAc进行定点突变 ，发现对 决定毒素的专一性和与受体的特异性结合。结构域Ⅲ 烟草天蛾和美洲烟芽叶蛾 (HeliothisvirescensFabri． 位于 c端，也是由B一折叠片构成，主要功能是调节毒 cius)的活性有所提高 。随后 ，Audthot4】、Alcantarat、 素的活性 ，在不同的毒素中具有不同的功能u】。 Baht61等分别对Cry1Aa、CrylAb和Cry2Aa进行研究， 目前已有 Cry1Aa等2【7种蛋白晶体的结构通过 均得到对鳞翅 目害虫活性提高的突变。 x一晶体衍射的方法解析；在此基础上 ，通过三维结构 结构域 Ⅱ和结构域Ⅲ是B折叠片层 ，结构相对稳 模型，对 Bt毒蛋白进行理性设计，选择相应的突变 定 ，对其进行突变 ，引起突变蛋白的结构和活性变化 基金项 目：8“63计划”(2006AA10A212)；国家 自然科学基金 通讯作者 。T