人sTNFR1基因克隆、融合表达与生物学活性.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（７）：８８～９３ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 研究简报殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 人ｓＴＮＦＲ１基因的克隆、融合表达与生物学活性  傅　蕾 　彭仕芳　谭德明　刘洪波 （中南大学湘雅医院感染病科　长沙　４１０００８） 摘要　采用ＲＴＰＣＲ，从Ｈｅｌａ细胞的ｍＲＮＡ中扩增人 ｓＴＮＦＲ１基因，构建含有目的片段的Ｔ载体 克隆及原核表达载体ｐＭＡＬｃ２ｘ重组质粒亚克隆，转化入大肠杆菌，测序证实其序列与基因数据 库中ｓＴＮＦＲ１基因一致。经异丙基Ｄ半乳糖苷酶（ＩＰＴＧ）诱导表达，淀粉树脂亲和层析法纯化， β 得到融合蛋白ｓＴＮＦＲ１ＭＢＰ。结果显示：经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测，ｓＴＮＦＲ１ＭＢＰ具有免疫活性； ＭＴＴ检测目的蛋白可有效地封闭ＴＮＦ 对ＱＳＧ７７０１的细胞毒性作用；流式细胞术检测目的蛋白 α 对ＴＮＦ诱导ＱＳＧ７７０１凋亡有抑制作用；ｓＴＮＦＲ１ＭＢＰ具有良好的生物活性，为今后的研究打下 α 了基础。 关键词　人ｓＴＮＦＲ１　克隆　原核表达　免疫活性　生物学活性 中图分类号　Ｑ７８５ 　　肿瘤坏死因子 （ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ ，ＴＮＦ）是 １．１．２　酶及主要试剂　ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接 α α α 由单核巨噬细胞分泌的具有多种生物学活性的细胞因 酶、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ购自ＴａＫａＲａ公司，ＭＭＬＶ逆转录酶和 子，能诱发肝细胞坏死和凋亡，其过度表达是肝功能衰 ＩＰＴＧ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＤＮＡ凝胶纯化试剂盒购自 ［１～４］ 竭发生发展过程中的一个重要因素 。ＴＮＦ 生物 Ｑｉａｇｅｎ公司，淀粉树脂购自ＮＥＢ公司，麦芽糖、二甲基 α 学作用通过特异性受体介导，而ＴＮＦ 的可溶性受体 亚砜（ＤＭＳＯ）、噻唑蓝（ＭＴＴ）购自Ｓｉｇｍａ公司，Ａｎｎｅｘｉｎ α ［５］ （ｓＴＮＦＲ１）可中和ＴＮＦ 的毒性作用 。为有效抑制 ＦＩＴＣ凋亡检测试剂购自生物晶美公司，ＴＮＦ、兔抗 α Ⅴ α ＴＮＦ 所诱发的细胞坏死和凋亡以及治疗肝功能衰竭， 人ｓＴＮＦＲ１多克隆抗体购自Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司，Ｗｅｓｔｅｒｎ α 本研究从克隆ｓＴＮＦＲ１基因、构建原核表达质粒入手， ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测试剂盒购自博士德公司，ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ 获得了具有生物学活性的重组蛋白ｓＴＮＦＲ１ＭＢＰ，为进 ＲＮＡ分离液、ＤＭＥＭ（高糖）、新生牛血清购 自美国 一步研究该蛋白在肝功能衰竭的作用奠定基础。 ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司，放线菌素Ｄ购自北京夏斯生物公 司，常用试剂为国产或进口分析纯。 １　材料方法 １．１．３　仪器　核苷酸测序使用ＡＢＩ３７７全自动测序仪 １．１　材　料 及配套的ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ试剂盒测序，由博亚公司完 １．１．１　细胞株、菌种与质粒　人Ｈｅｌａ细胞株由中南大 成；酶联免疫检测仪（ＥＬｘ８００型）为美国ＢＩＯＴＥＫ公司 学肿瘤研究所提供，ＱＳＧ７７０１人非致瘤性肝细胞株由 产品；流式细胞仪（ＦＣＭ）为美国Ｂｅｃｔｏｎ