我国褐牙鲆卵黄蛋白原的诱导及在环境激素检测中的应用.pdfVIP

MASTERAL DISSERTATION Induction of vitellogenin and its application in the environmental estrogen detection Supervisor: Jilin Lei / Zhenlin Hao Master candidate: Zhifeng Liu Major: Aquaculture LIFE SCIENCE AND TECHNOLOGY INSTITUTE, DALIAN OCEAN UNIVERSITY, DALIAN, LIAONING ，P. R. CHINA JUNE 2014 摘要 摘要 卵黄蛋白原（Vg ）是一种大分子的磷脂糖蛋白，作为卵生脊椎动物卵黄蛋白的前体， 在雌激素的调控下合成。一般情况下，只存在于成熟的雌性个体中，为发育中的胚胎提供 主要的营养物质，但当受到外源雌激素或具有雌激素效应的物质的诱导时，雄性个体和未 成熟的雌性个体也能表达大量的Vg ，因此Vg 可以作为一种良好的生物标志物来监测环 境雌激素的污染。本文克隆了褐牙鲆卵黄蛋白原基因的全长序列，并建立Real-Time PCR 的方法对雌二醇 （E2 ）和塑化剂（DIOP ）诱导下褐牙鲆肝脏组织中Vg mRNA 的表达量 进行检测，不仅为水产健康养殖提供理论指导也可为水环境内分泌污染的生物监测提供理 论依据，对生产养殖和水环境质量评估都具有较大的应用价值和社会效益。 本研究通过基因克隆，得到全长cDNA 序列，序列全长5066bp，开放阅读框5037bp， 编码1677 个氨基酸，对氨基酸序列分析发现，序列中存在从N 末端开始的信号肽序列， vitellogenin 区域、多聚丝氨酸区域及三个N-糖基化位点。与其他物种多重比较分析时发 现，序列中存在两个保守的N-糖基化位点和26 个保守的半胱氨酸残基。进化树同源性分 析发现，实验得到的褐牙鲆卵黄蛋白原属于卵黄蛋白原B （VgB ），与鲽形目、鲈形目同 源性分析在 80% 以上，与鳉形目、鳕形目同源性分析在 60%-70%之间，与两栖类、爬行 类、鸟类、关系较远。 本实验使用不同浓度（0.1μmol/L、1μmol/L 、10 μmol/L ）的E2 和DIOP 对褐牙鲆幼 鱼进行连续35d 的诱导实验，并对实验期间内，1h、3h、6h、12h、1d、2d 、3d、5d、7d、 14d、21d 、28d 、35d、进行取样，RT-PCR 结果显示，在E2 和DIOP 的诱导下，各诱导 组肝脏中VgB mRNA 都有明显的表达，E2 处理组中的各浓度组中的表达量要普遍高于塑 化剂处理组中的各浓度组中的表达量。在E2 和DIOP 诱导的三个不同浓度组中，卵黄蛋 白原mRNA 的表达量都呈现出先上升后下降的趋势，在第三天时达到最高值。 另外对0.1μmol/L 和 1μmol/L 的E2 和DIOP 处理组的褐牙鲆幼鱼的鳃、肝、肾进行 组织切片，观察雌激素类诱导物对褐牙鲆器官组织的影响，切片结果发现，在两种诱导物 的暴露下，鱼体组织都会产生损伤，并存在剂量、时间效应。切片显示，E2 处理组鳃小 片弯曲变细，末端弯曲膨大，鳃小片断裂，细胞坏死、脱落；肝细胞排列紊乱，肝细胞出 现肿胀现象，伴随着空泡化和脂肪变性；肾小管形态崩解，肾小管变细，肾小管管腔变大， 肾小球结构遭到破坏。DIOP 组鳃小叶之间发生组织增生、粘连，鳃小叶末端弯曲膨大， 出现非组织性空腔；肝细胞出现轻微的脂肪变性和空泡化现象；肾小管形态遭到破坏，出 现管细胞受损或不可见现象。 结果表明，褐牙鲆卵黄蛋白原在雌激素或者具有雌激素效应物质的暴露下，具有良好 的诱导效应，并可以通过RT-PCR 的方法进行灵敏准确高效的检测，其结果可直接反映污 染物对鱼体的危害，对生产养殖和水环境质量评估都具有较大的应用价值和社会效益，因 I 褐牙鲆卵黄蛋白原的诱导及在环境激素检测