基因结构与表达分析与研究基本策略.ppt

* 探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。 * ④实时荧光定量PCR计算原理 PCR扩增效率的差异使相同的样品最终产量有很大差异 * * CT或Tc或Ct值： 临界点循环（Threshold cycle ），即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数 * * ● 传染病诊断、监测与疗效预后评估： ● 揭示疾病发病机制 * ⑤ 荧光定量 PCR仪 带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，配有电脑系统及分析软件。 * （六）其它PCR技术 1. 反向PCR（inverse PCR）原理 * 2. Alu-PCR * 3. 原位PCR(in-situ PCR) 4. 巢式PCR（nested PCR） 5. 不对称PCR（asymmetric PCR） * DNA Chip and Microarray 四、 基因芯片和微阵列 ● 基因芯片上的阵列是由有规则排列的 cDNA或寡核苷酸等样本所组成的 。 * 宏阵列(Macroarray) 高密度 微阵列( Microarray ) 举例：HPV诊断芯片 * DNA微阵列： ● 寡核苷酸微阵列（oligomicroarray） ● cDNA微阵列（cDNA microarray） 在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子识别探针，能够平行分析大量基因转录表达，因此又被称为cDNA芯片。 * DNA芯片（cDNA芯片）主要技术流程： 样品荧光标记及芯片制备 杂交反应及过程控制 杂交信号检测 信号分析与解读 * C B A Cy5-标记 cDNA Cy3-标记 cDNA C B A C B A C B A C B A C B A C B A 样品1 样品2 Cy5/Cy3荧光标记 RNA提取 竞争性杂交显示 基因表达量差异 二种样品竞争性杂交示意图 基因表达谱芯片的原理 * DNA芯片技术的主要应用 基因组分析及发现新的基因 基因表达的研究 DNA序列分析 基因诊断和基因药物设计 * 五、 Western免疫印迹 Western blotting原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 * Western免疫印迹信号检测原理 * 蛋白质样品制备 SDS分离 蛋白质转膜 Western blot程序 * 抗体与抗原杂交 信号检测分析 * 谢谢大家！ * * * * * （二）平台期与平台效应 1. 平台效应（plateau effect）： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。 影响因素： ① 引物及dNTP底物浓度降低。 ② 酶与模板比例下降。 * PCR平台效应 * （二）耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶（实现了PCR自动化） 从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。 ● 95℃的半衰期: 40 min ● 最适温度: 72 ℃ ～80 ℃ ● 催化反应速率: 150～300核苷酸 / 秒/ 酶分子 * * Taq DNA聚合酶特性： ● 5′→3′聚合酶活性； ● 5′→3′外切酶活性； ● 较弱的非模板依赖性； ● 缺乏3′→5′外切酶活性。 * PCR thermal cycler * PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 500bp 400bp 200bp 300bp 1000bp 600bp 700bp 800bp 900bp Marker PCR产物 * 无机离子及抑制剂的影响 Taq DNA聚合酶的活性对Mg 2+ 浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。 最适Mg 2+浓度：2 mmol/L K+浓度：50 mmol/L * 几种高保真的耐热DNA聚合酶 1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶 * （三）PCR引物设计原则 引物的化学本质是什么？ 单链寡核苷酸DNA或RNA片段。 DNA复制引物：单链RNA片段 PCR引物： 单链DNA片段 * PCR引物设计原则： 1.引物与模板的序列要完全互补 2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配) * 5′C