动物细胞工程-动物细胞培养技术.pptxVIP

动物细胞工程范彩云第二节 动物细胞培养技术一、动物细胞培养的基本方法（一）原代培养 将动物机体各组织取出，经酶、螯合剂或机械方法处理，分散成单细胞，置培养基中培养，使细胞生存、生长和繁殖。 取材-制备培养材料-接种-加培养液-培养。原代培养的方法计数消化原代培养法（二）传代培养使原代细胞经过重新分散接种的过程称之为传代。每次分离再培养为一代，传5-10代以内的细胞称为次代培养细胞。10-20代以上的为传代细胞。取材制备培养材料接种加培养液培养（三）细胞的纯化与克隆细胞纯化：自然纯化和人工纯化细胞克隆：单个细胞分离技术。从细胞群体中分离出一个细胞，使其在体外培养体系中繁殖诚信的细胞群体，这种单个细胞所形成的细胞群或集落成为一个克隆，这种纯化后的细胞群体成为细胞株。（四）细胞的冷冻与复苏第三节 动物细胞融合一、动物细胞融合原理（一）细胞融合的概念 又称体细胞杂交，将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。（二）细胞融合的原理通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞，再以适当技术进行杂种细胞的分捡和培养，促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种个体，实现基因在远缘物种间的转移。二、细胞融合技术生物法第四节 杂交瘤技术和单克隆抗体技术杂交瘤技术的基本原理： 杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是： 骨髓瘤细胞：可在培养条件下无限分裂、增殖，即所谓永生性。 脾细胞（B淋巴细胞）：它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交才具有持续增殖的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞融合技术：分泌抗体短命长命不分泌抗体分泌抗体长命脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞骨髓瘤细胞/?骨髓瘤细胞脾细胞/?脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞不能长期存活不能长期存活筛选出杂交瘤技术的操作流程一. 动物免疫二、细胞融合及HAT筛选三、抗体的检测四、杂交瘤细胞的克隆化五、大规模培养——批量生产单克隆抗体杂交瘤技术的操作流程特定目标抗原一. 动物免疫能分泌针对于该抗原的特异性抗体免疫动物二、细胞融合及HAT筛选刺激三、抗体的检测脾脏中B淋巴细胞四、杂交瘤细胞的克隆化B淋巴细胞大量增殖五、大规模培养——批量生产单克隆抗体杂交瘤技术的操作流程一. 动物免疫融合效果更好，且避免了病毒的污染问题， 细胞融合方法二、细胞融合及HAT筛选1.病毒介导的细胞融合2.聚乙二醇（PEG）介导细胞融合 3.电激融合三、抗体的检测四、杂交瘤细胞的克隆化五、大规模培养——批量生产单克隆抗体杂交瘤技术的操作流程一. 动物免疫要求： 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品二、细胞融合及HAT筛选三、抗体的检测常用方法：四、杂交瘤细胞的克隆化1.酶联免疫吸附法2.间接免疫荧光法3.放射免疫法4.双相扩散法五、大规模培养——批量生产单克隆抗体有色产物酶标仪检测底物酶第2抗体第1抗体抗原酶联免疫吸附法(ELISA)技术原理：待检杂交瘤培养上清液杂交瘤技术的操作流程常用克隆化方法一. 动物免疫80个细胞/96孔饲养细胞(feeder cells)有限稀释法软琼脂平板法显微操作法二、细胞融合及HAT筛选三、抗体的检测ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。四、杂交瘤细胞的克隆化五、大规模培养——批量生产单克隆抗体常用的大规模培养方法：动物接种法转瓶培养法细胞培养罐法杂交瘤技术的操作流程一. 动物免疫二、细胞融合及HAT筛选三、抗体的检测四、杂交瘤细胞的克隆化五、大规模培养——批量生产单克隆抗体B淋巴细胞瘤的突变株动物免疫 X抗原BALB/c培养上清中X抗体的检测克隆化培养分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞无限生长细胞 培养数天后细胞死亡 单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测细胞融合混合细胞的HAT筛选) 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来分泌X抗体规模化培养获得大量单克隆抗体