第五章 重组基因导入受体细胞 2.pptVIP

二、依赖于重组子结构特征分析筛选 (一)快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳，由于重组DNA是载体DNA中插入了外源DNA片段，其分子量大于载体DNA分子，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带中，落后的带是重组DNA的带。 这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，直观快捷，只须获得质粒DNA分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。 此方法只用于重组子的初步鉴定。 (二)限制性内切核酸酶消化 载体被外源片段插入后，其限制性酶切割产物会发生变化，可根据电泳结果来判断外源基因是否插入了载体及其插入方向。 通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法难以区分期望重组子和非期望重组子，因为重组质粒DNA分子中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组。 采用限制性核酸内切酶分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子，且能判断外源DNA片段的插入方向及分子质量大小等。 基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。 完全酶切 简单操作过程是，用一种或两种能将外源DNA片段从重组质粒上切割下来的限制性核酸内切酶酶解质粒DNA，凝胶电泳后重组