家蝇幼虫血淋巴抗菌组分分离纯化与抗菌活性分析.pdfVIP

家蝇幼虫血淋巴抗菌组分的分离纯化与抗菌活性分析 张伟 张先文 赵小凡 王金星 山东大学生命科学学院，济南 250100 摘要：利用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合液诱导家蝇幼虫，抽取血淋巴。将无细胞的血淋 巴酸化以后用Sep-PakC18柱进行固相萃取，分别以10％、30％和80％浓度的乙腈 （ACN） 分步洗脱，将各洗脱组分冻干后分别测定抗菌活性。对10％和30%的固相萃取组分利用反向 高效液相色谱 （RP-HPLC）进行了分离纯化，收集各峰，并利用液体生长抑制法检测其抑菌 活性，发现10%组分和30%组分中分别有三个峰对大肠杆菌有很强的活性，10%组分有两个峰 对金黄色葡萄球菌有明显的抑制活性，而30%组分对金黄色葡萄球菌无明显的抑制活性。 关键词： 家蝇， 抗菌肽，固相萃取，反向高效液相色谱 在复杂的生存环境中，昆虫除了依靠其物理屏障来防御外来病原体的侵袭 以外，还可以通过自身免疫系统来破坏和消灭病原体。由于不存在适应免疫 (Hoffmann , 1995) ，所以它们主要依赖于先天性免疫，其免疫应答主要有三种反 应：蛋白水解级联反应,即昆虫受伤害刺激后引起的迅速的免疫应答,包括血液凝 集反应、酚氧化酶级联反应和调理作用(调理素与细菌表面抗原结合促进吞噬作 用) ；血细胞对入侵微生物的吞噬和包围作用；接受刺激后快速瞬时合成大量的 抗菌肽或多肽,这些分子主要是由脂肪体或血细胞合成,并迅速释放到血淋巴 (Machesky LM , et al . , 1993) 。 自首次从惜古比天蚕( Hy alop hora cecrop ia) 的滞育蛹中获得第一个抗菌肽 天蚕素(Cecropin) 以来(Hultmark , et al . , 1980) , 从各种生物体中获得的抗菌 肽分子有500 多种( Zasloff , 2002 ) 。昆虫抗菌肽是昆虫体内的一类小分子肽,当 昆虫受到外界微生物的刺激时,可由脂肪体(相当于脊椎动物的肝脏)大量迅速 地合成。它具有热稳定性强 ,强碱性,抗菌谱广等特点（Crucianietal.,1991）。 家蝇(Musca domestica) 属于双翅目、环裂亚目、蝇科、家蝇属,从幼虫到成 虫都生活在杂菌横生的污浊环境中,以机械性传播和生物性传播两种方式在人 类和其它动物之间传播多种疾病,如痢疾、伤寒、霍乱等。国内有很多学者对家 教育部博士点基金20020422052 资助。 通讯作者 蝇抗菌肽进行了研究，并采用多种方法进行了抗菌肽的纯化 （王远程等, 1992 ； 宫霞等，2004；安春菊等，2004）。我们对家蝇抗菌肽也进行了比较系统的研究， 先后纯化得到了一种抗菌肽，克隆得到了2种抗菌肽基因，并进行了重组表达研 究 （Wang Zhao，2001；陈留存等，2001；王来元等，2002；王来城等，2003； 王来城等，2005）。最近，我们又利用反向高效液相色谱 （RP-HPLC）等方法，对 家蝇幼虫免疫血淋巴进行了分析研究，从中得到了多个有抗菌活性的组分，为进 一步的分离纯化奠定了基础。 1材料与方法 1.1 动物材料与菌种 家蝇(Musca domestica)幼虫由本实验室饲养; 大肠杆菌(Escherichia coli )和 金黄色葡萄球菌(Stap hy lococcus aureus) 为本实验室保存。 1.2 试剂与设备 三氟乙酸 （TFA ） （HPLC级），乙腈 （HPLC级）购自Sigma公司； 甲醇 （一级色谱纯）天津四友。Sep-Pak C18柱 (Vac C18 6cc) 和HPLC反相柱 （150×3.9mm，C18 ，5µm，300Å ）购自Waters公司。高效液相色谱仪为岛津公司 产品 （Shimadzu LC-10ADVP ），冻干机为MODULYOD-230 ，ThermoSavant ）， 酶标仪为ELX800 ，Universal Microplate Reader(BIO-TEK INSTRUMENTS.INC) 。 1