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利用指示细胞系定量分析牛泡沫病毒的感染1 马喆，郝朋，姚雪，刘畅，刘力，耿运琪，陈启民，乔文涛 南开大学生命科学院微生物系，天津（300071 ） E-mail ：wentaoqiao@ 摘 要：利用牛泡沫病毒（bovine foamy virus, BFV ）感染细胞后可以激活BFV 的长末端重 复序列（long terminal repeat, LTR ），在LTR 下连入egfp 基因的质粒转染仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells, BHK-21 ）。经过G418 的筛选LTR-egfp 稳定整合细胞株，经三次单克隆 化，最终从48 株阳性克隆中得到一株本底表达水平最低，在BFV 感染后GFP 得以高效表 达的细胞，命名为BICL （BFV indicator cell line ）。对于可以出现细胞病变（cytopathic effects, CPE ）的情况，通过观测BICL 中GFP 的表达情况，用TCID50 的方法检测BFV 的滴度： 同传统的观测CPE 的方法比较，BICL 方法在感染后5-6 天就可以检测到最终滴度，而CPE 则需8-9 天。同时，前者比后者灵敏度高出100 倍。对于CPE 无法检测的病毒潜伏性感染， BICL 中GFP 表达可指示其感染。利用这种简单，快速的方法，我们在体外检测了BFV 的 宿主范围。结果表明BFV 能感染牛，人，鼠和猴的多种细胞。这说明BICL 不仅结果可靠， 而且比CPE 的方法更加快速，灵敏。 关键词：牛泡沫病毒，指示细胞系，感染 1．引言 泡沫病毒（foamy virus, FVs ）是一类复杂的反转录病毒。原病毒DNA两端为长末端重 复序列（long terminal repeat, LTR ），中间除含有gag 、pol 、env三个结构基因外，在env基因 与3’LTR间存在2 －3个读码框，编码病毒的反式激活因子（transactivator of spumavirus ，Tas ） 等辅助蛋白[1,2]，Tas在原型泡沫病毒（prototype foamy virus, PFV ）中称为Bel-1 ，在BFV 中 则称为BTas 。Tas蛋白对FVs 的感染至关重要，因为它能激活LTR起始的转录[3-5] 。因此，Tas 蛋白的表达水平反映了FVs在细胞中的感染情况。 定量检测病毒的滴度是研究FVs 的生物学特性和复制策略不可缺少的步骤。虽然传统的 细胞病变（cytopathic effects, CPE ）的方法被广泛的使用，但是存在耗时长，工作量大和灵 [6] [7-9] 敏度低等问题 。除此之外，很多细胞被病毒感染后并不出现细胞病变 。为了解决这个 难题，一种基于RT-PCR 的方法被引进到了PFV 的检测中。但是由于RT-PCR需要相对高的技 [10-12] 能，而且不能检测病毒感染的情况，因此未能得到大规模的推广 。 目前，基于激活FVs 的LTR 的指示细胞系的方法被提出。病毒的滴度可以通过检测LTR 下游的报告基因的表达来检测。报告基因主要包括β半乳糖苷酶（β-gal ），萤火虫荧光素酶 （luc ）和绿色荧光蛋白（egfp ）基因等。在这些报告基因中，检测EGFP是最简单的，因为 [13-15] 它不需要酶作用或固定细胞 。 本文，我们在BFV LTR下连入egfp基因的质粒转染仓鼠肾细胞（baby hamster kidney cells, BHK-21 ），并进行大规模筛选最终成功获得了以egfp基因为报告基因的BFV 的指示细胞系。 利用该指示细胞系检测BFV 的滴度比传统的CPE 的方法要灵敏100倍。同时，通过该指示细 胞系，我们还在体外检测了BFV3026 的宿主范围。 2 ．材料与方法 2.1 细胞和病毒 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20040055