RNA干扰技术在哺乳动物中应用hg.docVIP

摘要　RNA干扰(RNAi)是生物界普遍存在的一种抵御外来基因和病毒感染的进化保守机制.RNAi是由双链RNA触发的转录后基因沉默机制,具有序列特异性,在哺乳动物细胞中,RNAi由21～23个核苷酸组成的双链RNA引发.小干扰RNA(siRNA)可以在体外合成或通过表达载体在哺乳动物细胞内合成.由于RNAi技术具有快速、简单和特异性强等特点,在基因功能研究、抗病毒治疗和抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景. ?? 关键词　RNA干扰,小干扰RNA,哺乳动物 ??? RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(doublestrandsRNA,dsRNA)引起的,广泛存在于动物植物中的序列特异性转录后基因沉默过程,是生物体在进化过程中,抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起基因组不稳定性的保护机制.Elbashir等[1]发现,一种称为短干扰或小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的RNA干扰中间体,能在果蝇中导致mRNA的降解.这种iRNA为21个核苷酸,形成19bp的双链RNA分子,3′端有2个核苷酸突出(overhang),可激活哺乳动物细胞的RNAi机制. ??? 1RNAi的机制 ??? RNAi在哺乳动物中的机制基本上与果蝇和其他低等生物中RNAi的机制相似[2,3].基本步骤由启动和效应步骤构成[4],启动步骤为较长的双链RNA经过RNA酶核酸酶(Dicer)处理后,降解成21～23个碱基的siRNA,siRNA与靶mRNA有高度的序列特异性.siRNA在3′端有2个碱基突出.效应步骤为siRNA与RNA酶结合形成一个RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),RISC是分子质量为50ku的内源性核酸酶,并与siRNA序列互补的内源性mRNA结合,核酸酶在siRNA2mRNA结合体3′端大约12个碱基处切割mRNA,使之丧失转录信息,达到特异性抑制目的基因表达效果. ?　2RNAi在哺乳动物细胞中的应用 ??? 2.1体外合成siRNA ??? 如何实现哺乳动物细胞中RNAi,目前使用得最多最广泛的是siRNA双链复合体(depluxes).siRNA双链复合体是根据靶mRNA序列设计的21个核苷酸的双链,由一条正义链和反义链组成,其中正义链19个核苷酸序列与靶序列相同,3′端有2个碱基突出,一般为UU或dTdT,反义链19个核苷酸序列与正义链互补,3′端也有2个碱基突出,一般为dTdT或UU,3′端dTdT结构对siRNA双链复合体的稳定性有很大贡献,而3′端UU结构有利于siRNA介导的基因沉默.研究哺乳动物RNAi机制的学者建议,最有效的双链siRNA序列应该是与靶mRNA序列互补的19个核苷酸序列,外加3′端2个碱基突出构成21个碱基的双链RNA,研究表明[3]siRNA双链的反义链具有识别靶点基因序列的功能,而正义链没有序列识别功能.在设计双链siRNA时,通常将mRNA开放阅读框区域作为作用靶点,从启动子下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的靶序列.为了避免mRNA调控蛋白的影响,3′端和5′端非翻译区域或者启动子不应该作为作用靶点.Tuschl等在化学合成21～23ntsiRNA方面的研究取得了很好的成绩[5].目前已经有多家公司可以提供siRNA化学合成服务,比较著名的有Dharmacon()、Qiagen()、Proligo()和Ambion()等.厂家可进行siRNA序列设计和合成,他们采用(AA2N19)标准进行siRNA设计,即19nt+dTdT或UU,19nt序列基础上在3′端加2个碱基(图1).研究者也可以根据自己的需要进行设计,RNA最大合成碱基数量为80nt,为了防止siRNA的降解,siRNA通常采用了碱基保护措施,使用前根据试剂盒提供的缓冲液和步骤去保护.采用2′2ACE技术保护的合成RNA冻干粉,在-20可以保存1年.另外,siRNA的保存时间与siRNA自身序列、所采用的保护方法、保存温度等因素有关.2p-OH形式的RNA可以保存6个月.研究表明,以AA-N19标准设计的siRNA,在哺乳动物细胞中70%～80%有RNAi作用. ??? AA-N19设计原则:从启动序列下游75个碱基开始寻找第一个AA序列,确定AA序列之后的19个碱基序列为目的序列;计算AA2N19221序列中的G/C含量比值,G/C含量应该在30%～70%之间,最好为50%.如果在此序列中G/C含量不能达到要求,继续寻找下一个AA序列,直到获得满意结果.在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索,确认所设计siRNA序列的唯一性.如果未达到要求,重新设计. 按照Tuschl等设计原则[5