柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸.pdfVIP

柱前衍生高效液相色谱法测定氨基酸 梁冬生 常碧影 （国家饲科质量监督检验测试中心，北京100081） 自从Moore等 提出色谱法定量分析氨基酸以 荧光，在紫外区有较强吸收。它可做高灵敏度荧光检 来，传统的离子交换色谱及柱后茚三酮衍生检测方 测，又可做一般的紫外吸收检测。紫外检测线性范围 法始终占着主导地位。三十多年来，人们对该法及仪 为10－? 200pmol荧光为0.8-15pmo1。OPA本身不 器做了大量的研究与改进工作，使分析的灵敏度、速 干扰分离与检测，不必除去过量试剂，色谱图基线也 度以及白自动化程度有了很大的进步 ，而且以此为 比较平稳。图1为OPA衍生法测定蛋白水解液的色 基础，建立了食品、饲料等有关 基酸分析的一系列 谱图。 国际和国家标准。然而，随着氨基酸分析应用领域的 OPA柱前衍生反相HPLC法比传统柱后衍生 扩展，氨基酸测定仪用途单一、结构复杂、价格 贵 有更高的分辨率和灵敏度(9)多数氨基酸检测极限 等缺点日显突出。自七十年代以来，随着高效液相色 为0.5pmol（以信噪比2.5：1计），只有组氨酸和赖氨 谱的发展，特别是键合反相色谱的应用及柱前衍生 酸较高，分别为2.5和3.5pmolOPA法蛋白水解液 技术的发展，为氨基酸分析提供了广阔的前景 。目 变异系数一般为2-3.4%(CV)，生理体液为4 前不少方法已趋于成熟，并且逐步被临床化学、蛋白 7%（手动衍生off-line)酪氨酸和组氨酸的大些，为 质化学、生理研究以及食品、饲料营养分析者所认可 8-10%表1给出了OPA等方法测定结果与理论值 与采用。这些方法大多具哂有衍生操作简洁,徊产生或 的比较。 易于排除干扰物、色谱分离分辨率高，灵敏度高，分 OPA法最大缺点是：1．不能与带有仲氨基团的 析时间短以及仪器简单、也可一机多用等优点。但也 脯氨酸或羟歉脯氨酸反应，因此做全谱分析时需配以 有各自的欠缺与不足。本文就是根据我们的经验及 其它技术（如与FMOC衍生剂一起使用).赖氨酸 有关的文献[45]，对 前应用最广、影响最大的几种 及胱氨酸衍生物荧光较弱，灵敏度低，近年来有人提 柱前衍生反相高效液相色谱测定氨基酸的方法—— 出加Brij35和碘乙酸酯使其灵敏度提高 3.OPA的 邻苯二甲醛(OPA)法、氯甲酸药甲酯（或叫9-芴基甲 氨基酸不稳定，特别是甘氨酸、赖氨酸衍生物的信号 氧基羰酰氯FMOC法、异硫氰酸苯酯(PITC)法和 衰减很快，此法多用于全自动的在线衍生(on-line)。 丹酰氯(即二甲氨基萘磺酰氯Dansyl-Ci)法进行讨 4.OPA法分析配合饲料氨基酸回收率较低，这可能 论和研究，介绍它们的基本原理、特点，列出各自的 是配合饲料中的盐分影响了衍生(l0)。 色谱图和有关数据（与离子色谱法比较）等。 二、氯甲酸药甲醋(9-药基 一、邻苯二甲醛OPA）法 甲氧基狱酞氯,FMOC) 邻苯二甲醛(OPA)衍生法，早在1971年就由 Roth提出，由于其灵敏度比茚三酮法高出十倍，故 氯甲酸药甲酯ナ是多肽合成的氨基保护剂。它能 最初作为一种柱后衍生剂，后来才作为柱前衍生剂 与带有伯、仲氨基团的氨基酸反应，生成衍生物可被 使用Jones等(7)提出的衍生方法如下： 反相高压液相色谱分离。衍生物又具有荧光（也有紫