前脑特异性Presenilins双敲除小鼠模型中线粒体结构与功能探讨.pdfVIP

前脑特异性Presenilins双敲除小鼠模型中线粒体 结构与功能的探讨 摘要 越来越多的证据表明线粒体功能障碍在多种神经变性疾病的发生中起重要 作用。包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和亨 廷顿病(HD)等以及一些与年龄相关的疾病，其发病率随老龄人口的增加而逐年增 高。虽然至今尚不清楚导致这些疾病的真正原因，但线粒体功能障碍、能量代谢 异常作为这些神经变性疾病的早期病理现象已成为共识。线粒体不仅是能量的加 工厂，也是自由基产生的场所。其功能障碍引起能量产生不足和氧化损伤，最终 会导致神经元变性和细胞凋亡。线粒体在神经元凋亡中起着举足轻重的作用，包 括线粒体跨膜电位的破坏，Caspase酶系的活化，细胞色素C的释放等。线粒体的 功能和机制研究对于寻找很多疾病的原因和治疗手段具有重要意义。 conditional Presenilins(PS)双敲除转基因模型动物(PSknockout，cDKO)表现 出神经退行性病理变化，包括认知能力衰退和前脑退化等。该模型没有AB的沉 积，导致这些病理现象的原因和机理尚不明确。本实验旨在考察该模型的线粒体 结构功能变化以探讨PS基因与线粒体的关系，以及线粒体功能与该模型病理现象 的关系。此外，该模型没有Ap的沉积，但也表现出类似AD的症状，为了探讨AD 的沉积对AD的形成是否必要，我们考察了AD对SHSY5Y细胞线粒体的影响，结 果显示AD对该细胞的线粒体各方面都有很强的损伤作用。综合这些结果，可以 看出引起神经元丢失，脑室扩大，认知衰退的原因是多方面的，AB沉积至少是 加速AD形成的一个重要原因，而PS基因参与的线粒体途径可能是导致cDKO小 鼠病症的原因之一。 1．cDKo小鼠线粒体的结构功能的探讨 选取3，6，9，12月龄的cDKO和野生型(WT)小鼠的皮层，用蔗糖等渗溶液 提取线粒体，在电镜下观察线粒体的形态、嵴等特点，结果表明在早期PS基因敲 除对线粒体结的构形态没有明显影响，但在12月龄cDKO小鼠中外膜结构模糊的 线粒体数目有所增加，同时检测到12月龄的cDKo小鼠线粒体膜势能有所下降， 随后我们考察了各基因型小鼠线粒体电子传递链各个复合物I， II，IⅡ和Ⅳ的 活性，结果与电镜结果一致，在早期没有明显差异，但在9月龄和12月龄时cDKO 小鼠复合物I活性下降。此外，对仅．CaMK II和AMPK磷酸化水平的检测也表明 PS基因对早期线粒体能量代谢的影响不大，而主要是表现在晚期的一个综合性的 代谢混乱。同时，对参与线粒体融合分裂的几个基因的分析发现在12月龄时cDKO 下降从3月龄就已经开始并持续到12月，提示cDKO小鼠线粒体融合分裂动态平衡 被打破。同时OPAl作为一个抗凋亡蛋白，推测cDKO小鼠脑室的扩大，神经元的 丢失也可能与OPAl参与的细胞色素C快速释放的凋亡途径有密切关系。 2．Apl-42对SHSY5Y细胞线粒体的结构功能影响 我们用10¨M 的势能，参与调节线粒体动态平衡的基因，电子呼吸链复合物的活性、细胞色素 C氧化酶以及能量感应器脚K的表达。结果显示Apl_42能降低线粒体的势能， 破坏线粒体分裂融合的动态平衡和能量代谢。这些结果表明Ap能明显损伤线粒 体功能并影响细胞凋亡。然而在该细胞模型上观察到的能量代谢混乱，与cDKO 小鼠模型的能量障碍有明显的区别，主要表现在抑制的呼吸链酶活性复合物的不 同和对AMPK途径依赖性的不同。说明PS双敲除小鼠的病症可能与AD的毒性途 径不同且PS基因可能有未知的重要功能。同样，在SHSY5Y细胞模型上对线粒体 动态平衡基因的检测也发现Ap破坏了线粒体分裂融合的动态平衡。 关键词 线粒体，Presenilins，融合／分裂，OPAl，Apl-42 Ⅱ MitochondrialStructuralandFunctionalin Analysis ForebrainPresenilin—landPresenilin一2DoubIe Specific