HRP标记抗体的方法.docVIP

HRP标记抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠发。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法 1、原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白结合物。 2、标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于12.5mL/L戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/min，收集棕的流出液。如体积大于5mL，则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体112.5mg用生理盐水稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M pH9.5碳酸盐缓冲液0.25mL，继续搅拌3~4小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25mL，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 （7）3000rpm/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M、pH7.4的PBS中。 （8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M、pH7.4的PB缓冲液透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000rpm/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3、结果判定 （1）定性及效价测定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散实验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA（或正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（见（三）工作浓度的选择）。 （2）本法标记步骤比较简单，重复性好，缺点是酶的利用率低，一般只有2%~4%的酶与蛋白质结合。 4、试剂和器材 （1）0.1M、pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS）：取0.2M Na2HPO4 49mL ，0.2M NaH2PO4 51mL, NaCl 1.8g，加蒸馏水至200mL。 （2）12.5mL/L戊二醛液：取250mL/L戊二醛50mL与pH6.8的PBS确？mL混合。 （3）1M、pH9.5碳酸盐缓冲液（PBS）：取1M Na2CO3 3mL 与1M NaHCO3 7mL混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M、pH9.5碳酸盐缓冲液1mL中。 （5）0.15M、pH7.4的PBS及生理盐水。 （6）pH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇（PEG、MW2000）。 （8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。 （9）HRP（RZ3.0）。 （10）SephadexG-25层析柱（2cmX50cm）。 （11）搅拌器、分光光度计、离心机。 （12）透析袋、大小烧杯，试管，吸管等。 简易过碘酸钠法 本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶集合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前最常用的方法. 1、原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低pH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，后者可进一步用兵NaBH4（或乙醇胺）还原生成稳定的酶标记抗体。 2、标记步骤 （1）称取5mgHRP溶解于1mL蒸馏水中。 （2）于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。 （3）将上述溶液装入透析袋，对1mM, pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。 （4）加20μL 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化物的pH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mgIgG，室温避光轻轻搅拌2小时。 （5）加0.1mL新配的4mg/mL NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。 （6）将上述溶液装入透析袋，对0.15M， pH7.4PBS透析，4℃过夜。 其余步骤（纯化）同戊二醛标记步骤的（6）、（7）、（8）。 3、结果判定 除标记物igG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。 IgG量（g/L）=（OD280nm-OD403nmΧ0.3）Χ0.620.1M NaIO4：称取保241mg高碘酸钠溶于10mL蒸馏水中。 （2）1mM, pH4.4的醋酸钠缓冲液0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液pH9.5的碳酸盐缓冲液4mg/mL NaBH4液NaBH4 4mg溶于1mL蒸馏水中。 （5）其他试剂及器材可参见戊二醛标记法。 工作浓度的选择 在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素