南农 生物分离工程 双水相萃取课件.pptVIP

双水相萃取技术 Aqueous Two-Phase Extraction ATPS 发展历史 1896年 Beijeronck将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象 1956年 Albertsson分离叶绿体,开创了双水相 萃取技术,解决了蛋白质变性和沉淀的问题。 1979 年德国 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离 建立ATPS的相图 研究蛋白质、核酸、病毒、细胞、细菌、海藻、叶绿体和线粒体等在ATPS 中的分配系数 双水相的形成 聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。 除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，  双水相的形成 PEG6000， Dex的相对分子质量如下： 1.D5 (Mn2800， Mr3400) 2.D17(Mn23000，Mr30000) 3.D24(Mn23000) 4.D37(Mn88000，Mr179000) 5.D43(Mn180000，Mr460000) 6.D170(Mn630000，Mr2200000) Mn—数均分子量 Mr—重均分子量 双水相萃取的原理 一般而言，离子性大的蛋白质会出现在下层盐相，而疏水性较大的蛋白质则在上层聚合物相 各种细胞，噬菌体的分配系数一般大于100，或小于0.01; 蛋白质(如酶)的分配系数在0. 1 -10之间， 无机盐的分配系数一般近于1. 0 分配系数的差异，构成了双水相萃取分离物质的基础。 双水相萃取的原理 生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，主要有 静电作用 疏水作用 生物亲和作用 分配系数是各种相互作用的和: lnm=lnme+lnmh+lnml me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。 　双水相萃取法流程图 　双水相萃取的工艺流程 目的产物的萃取 PEG的循环 无机盐的循环  PEG的循环: 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; 将PEG相通过离子交换树脂,用洗脱剂先洗去PEG,再洗出蛋白质。 无机盐的循环　 将含无机盐相冷却，结晶，分离 电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 影响生物物质分配的主要因素 影响物质分配的因素用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。 1 双水相中聚合物及其分子量的影响 降低聚合物的分子量，则蛋白质易分配于富含该聚合物的相中 聚合物的疏水性按下列次序递增: 葡萄糖硫酸盐 甲基葡萄糖 葡萄糖羟丙基葡聚糖 甲基纤维素 聚乙烯醇聚乙二醇 聚丙三醇 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加 系线长度对分配平衡的影响 以PEG—(NH4)2SO4系统双水相萃取糖化酶为例， 当PEG400浓度在25％～27％时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配； 在PEG400浓度固定为26％时，增加(NH4)2SO4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要是由于(NH4)2SO4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度为16％，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生沉淀。 3 盐和缓冲液的影响 产生不同相间电位 影响蛋白质的表面疏水性 扰乱双水相系统，改变各相中成相物质 的组成和相体积比 例如，PEG/KPi系 统随添加NaCl浓度的增大而改变。 pH 值的影响 改变两相的电位差。如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大, 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 双水相萃取特点 体系有生物亲和性，相界面张力小 平衡时间短，操作简便， 易于放大，分配系数K值重复性好， 可与细胞破碎相结合 广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化 双水相萃取技术的应用 目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。 处理细胞匀浆液，既可方便地除去细胞碎片，还可使酶得到精制。 应满足下列条件 ①欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中； ②酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时一次萃取，就能得到较高的收率； ③两相用离心机很容易分离。 萃取操作时单位重量相系统中匀浆液的加入量一般每1 kg萃取相系统以处理200～400 g湿菌体为宜。 使用PEG／盐系统提取胞内酶时，使细胞碎片分配到下相中是比较容易的，如用18%的PEG 1550、7％磷酸钾系统处理20％湿细胞碎片时，细胞碎片能全部转入下相(盐相)。 　连续错流萃取回收酶的流程图 双水相体系提取酶和蛋白质 　双水相萃取技术在医药工业中的应用 　基因工程药物