大蒜细胞SOD的提取与分离.docVIP

实验四十五　大蒜细胞SOD的提取与分离 一. 实验目的 学习超氧化物歧化酶的提取与分离方法 二. 实验原理 超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2－＋H2＝＝O2＋H2O2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 三. 实验方法及步骤 1．组织或细胞破碎 称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。 2．SOD的提取 将上述破碎的组织或细胞，加入2－3倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。 3．除杂蛋白 提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。 4．SOD的沉淀分离 将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。 将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。 将上述粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。 5．SOD活力测定 取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(ml) 试　　剂 空 白 管 对 照 管 样 品 管 碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0 EDTA溶液 0.5 0.5 0.5 蒸馏水 0.5 0.5 － 样品液 － － 0.5 混　合　均　匀 肾上腺素液 － 0.5 0.5 在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应5min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管与样品管的光密度值分别为A和B。 在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即： 　　　　　　　　　酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A 式中　　N――样品稀释倍数； 　　　　2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。 若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算： 　　　　　　酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A ·V/V1＝26·（A－B）·N/A 式中V――反应液体积（6.5ml）； 　　 V1――样品液体积（0.5ml）。 　　最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化回收率。 四. 附注 材料和试剂 （1）新鲜蒜瓣 （2）磷酸缓冲液：0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲溶液。 （3）氯仿－乙醇混合溶剂：　氯仿：无水乙醇＝3：5（V/V）。 （4）丙酮：用前冷却至4－10℃。 （5）碳酸钠溶液：0.2mol/L。 (6) EDTA溶液：0.1mol/L。 (7) 肾上腺素液：1mg/mL。