急性缺血心肌脂肪酸代谢的变化.docVIP

摘要】 目的 观察急性缺血心肌心脏型脂肪酸结合蛋白（HFABP）表达及血清游离脂肪酸（FFA）含量的动态变化。方法 健康SD雄性大鼠随机分为对照组和5个实验组(实验1、2、 3、4、5组分别为心肌缺血1、2、4、6、12 h);HE染色观察各实验组心肌缺血后病理形态学改变，用Western印迹检测心肌HFABP表达的变化，用一步提取比色法测定血清FFA含量。结果 （1）缺血2、4 h组心肌细胞明显肿胀，有部分形成了“收缩带”；缺血6、12 h心肌细胞边界不清、局灶性凝集坏死，缺血12 h组有大量炎性细胞浸润。（2）Western印迹法检测： 实验2、3、4、5组与对照组比较心肌HFABP蛋白均表达下降，实验4组降低约41%（P＜0.01）。（3）FFA测定：实验2、3、4、5组与对照组比较大鼠血清FFA含量均不同程度升高，尤以缺血2、4 h组为甚（P＜0.01），分别升高约2.01倍和2.72倍。结论 急性心肌缺血后HFABP表达明显下降，血清FFA含量明显升高，可能导致心肌细胞代谢紊乱，促进心肌肥厚重构。 【关键词】 心肌缺血；脂肪酸结合蛋白;能量代谢；脂肪酸 缺血性心脏病是世界范围内主要的致死和致残原因，仍需寻找更有效的治疗缺血心肌的方法〔1〕。事实上受损的能量供给是缺血性心脏病的中心环节〔2〕。心肌缺血时脂质代谢的改变，可引起膜的流动性、渗透性或信号级联的变化，对心脏的生理功能产生复杂影响。心脏型脂肪酸结合蛋白（hearttype fatty acidbinding protein，HFABP）富含于心肌细胞的胞浆内，参与了心肌脂肪酸的代谢过程，对心肌细胞有不同方面的保护作用〔3〕。目前急性缺血心肌组织HFABP 表达研究仅有急性心肌缺血后20、40 min及1 d后的变化〔4，5〕。本研究观察急性心肌缺血后1～12 h心肌组织HFABP动态表达，以期揭示HFABP在急性心肌损伤中的改变，为临床防治急性心肌缺血提供新思路。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 山羊抗大鼠HFABP抗体(Santa cruz,美国)，小鼠抗GAPDH抗体购自上海康成生物公司，HFABP引物、βactin引物由上海生工公司合成。 1.2 动物模型及分组 SD大鼠60只，购于河北医科大学动物中心（动物中心许可证：04064），雄性,体重250～300 g，随机分为6组，每组10只。对照组：麻醉开胸穿线不结扎组;实验1组：心肌缺血1 h组(模型成功7只);实验2组：心肌缺血2 h组(模型成功8只);实验3组：心肌缺血4 h组(模型成功8只);实验4组：心肌缺血6 h组(模型成功7只);实验5组：心肌缺血12 h组(模型成功6只)。 实验组按Selye法〔6〕结扎大鼠左冠状动脉前降支复制急性心肌梗死动物模型：以3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，固定动物、皮肤消毒、气管插管、接动物呼吸机，于左锁骨中线第4、5肋间钝性分离肌层开胸，轻压胸廓及腹部，挤出心脏，以肺动脉圆锥和左心耳交接处为标志，于左冠状动脉起始端，穿过心肌浅中层快速结扎，肉眼观察心脏左室前壁颜色变苍白，迅速还纳心脏入胸腔。观察心电图，以肢体Ⅱ导联ST段抬高≥0.1 mv或QRS波明显增宽持续30 min以上为结扎成功的客观指标。行TTC及Evans染色区分梗死区、缺血区和非缺血区。对照组开胸后即刻取心肌，实验组分别于左前降支闭塞后1、2、4、6、12 h麻醉后腹主动脉放血处死留取缺血区心肌组织，-80℃保存。 1.3 石蜡包埋HE染色心肌组织 取结扎线下心室组织，用4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片后进行HE染色，封片后光学显微镜下观察心肌组织病理学改变。 1.4 Western印迹法检测 （1）提取各组心肌组织总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。每组各取100 μg 蛋白经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜，再用一抗（HFABP多抗1∶100）4℃过夜，二抗（抗山羊1∶3 000）室温孵育1 h， DAB显色，数码相机拍照，凝胶图像分析系统（GelPro Analyzer Version 3.0）分析结果。 1.5 血清游离脂肪酸的测定 根据游离脂肪酸（FFA）检测试剂盒（南京建成生物公司研究所）说明进行。用铜试剂测定其中铜离子的含量，即可以推算出游离脂肪酸的含量。 1.6 统计学分析 数据均以x±s表示。采用SPSS 10.0统计软件,组间差异用单因素方差分析（one way ANOVA）,有显著差异者用最小显著差法（least significant difference，LSD）进行两两比较。 2 结 果 2.1 心肌组织病理学