通过三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库对免疫相关基因多个亚型进行的研究翻译.docVIP

通三疣梭子蟹和眼柄cDNA基因多个亚型表达序列标签(est)分析已被证明是一种有效的方法不仅对基因的发现,但也对基因表达谱数据的性能。 两个完整的浓缩cDNA是通过梭子蟹属的和眼柄分别随机收集基因组息和识别基因参与免疫防御反应。包括64 (6.00%的1066 unigenes)在通过和35(6.86%的510 unigenes)在眼柄库标识共99 unigenes免疫基因。 这些基因分为六类抗菌肽,氧化还原蛋白质,黑化作用相关的蛋白质,蛋白,蛋白和其他免疫因素。在眼柄库免疫基因表内容和类别眼柄可能包含多个蛋白质亚型的五免疫基因识别,包括反垄断糖类因子(PtALF1-7)crustin (PtCrustin1-3)、硫氧还蛋白(PtTrx1-2),夹域丝氨酸蛋白酶(PtcSP1-5)和kazal蛋白酶抑制剂(PtKPI1-4) 序列比对和显示包含两个半胱氨酸残,可能是由多个基因位点进行编码。PtCrustin1-3分享半胱氨酸的主题,被认为crustins1型PtTrx1拥有结构半胱氨酸残基Trx- 1的C 73，而PtTrx2有Trx - 2的N-末端的线粒体易位信号。 序列分析表明PtcSP15 ，包含一个夹域和一个部分SP催化三联域。 PtKPI1 -4一个典型的Kazal域6个保守的半胱氨酸残基。 一些蛋白异构体组织特异性，这可能会他们有不同的起源，并执行不同的功能。 除PtALF1 -3和PtCrustin1 ，其他三疣梭子蟹这项研究中首发现。特别是， PtTrx2首甲壳类动物。 我们的研究将提供有用的基因组信息，蟹免疫的分子机制的了解。cDNA文库构建设和表达序列标签(est)分析是有效的方法收集并识别有用基因他们被发现新人类基因但现在广泛用于研究重要水产养殖动物包括鱼类虾和螃蟹的基因组学EST数据库基因表达分析丰富的资源,可以特定组织提供一个许多的基因和表达特征,这基因功能,组织生理学和是非常有用的这种甲壳纲动物在宿主免疫反应起着非常重要的作用包括识别、吞噬作用,,细胞毒性和细胞信号交流EST数据库开发了甲壳纲动物物种,各种免疫相关的基因进行了表征 免疫基因,多个蛋白质亚型报道在一个生物体共存。例如,至少五个不同的亚型的抗脂多糖因已确定在中国对虾几个crustins亚型凡纳滨对虾和少12和六kazal蛋白酶抑制剂小龙虾甲壳纲动物眼柄是一个重要的神经内分泌器官复有独特的能力来调节许多生理过程包括脱毛、生长和生殖[19、20]。EST的研究进行了几眼柄甲壳纲动物物种包括对虾。许多基因专门参与视觉神经内分泌系统如、甲壳纲动物高血糖的激素(CHH)、脱皮抑制激素和(MIH)和颜料分散激素(PDH)。然而,直到现在,很少知道眼柄免疫角色。梭子蟹属在中国是一个重要的水产养殖物种频繁爆发的疾病导致减少和经济损失分子机制蟹免疫力的研究可能在蟹农业有利于发展更好的水产养殖管理策略然而,基因序列信息在公共数据库是非常有限的研究主要的是构建一个完整cDNA库,和执行est序列分析, 确定免疫基因尤其是那些蛋白质组织收集和RNA一个男性梭子蟹(305.36克)中国青岛一个商业农场获得。这个眼柄蟹切割从腿使用注射器血淋巴,并迅速添加到一个等体积的-混凝剂血-淋巴样立即在800 g,4 c 10分钟收集。和眼柄总RNA试剂(表达载体) 被信使纯化与Oligotex工具包(试剂盒)。总RNA和信使RNA的完整性都是例行审查与1%琼脂糖凝胶电泳。 cDNA文库构建通过姬氏和眼柄cDNA图书馆是构建的创造者智能cDNA图书馆建设工具根据厂商的协议(Clontech)。合成了第一股cDNA使用MMLV逆转录酶与智能IV寡核苷酸底漆和CDSIII / 30 pcr底漆。双-滞留cDNA(ds cDNA)合成了长途PCR(ld PCR)与50个PCR底漆和CDS III / 30 PCR底漆。ds cDNA立即被接受蛋白酶K(0.8毫克/毫升)为20分钟在45度,然后SfiI消化。消化产品,电泳分离1.0%琼脂糖凝胶。1 e3 kb碎片被凝胶纯化和克隆成pDNR-LIB向量。个体克隆从两个cDNA库,随机选择96孔板包含1.0毫升LB培养基 在37 c一夜之间及孵化。质粒DNA准备使用碱性溶菌制剂协议[26]。插入测序的cDNA从50端使用M13t通用引物在一个ABI3730汽车——交配音序器(应用生物系统)。EST组装、注释和生物信息学分析原始序列的est被程序Phred处理。向量和适配器序列交叉匹配程序。est序列( 100个基点) Phrap程序被组装成连续的序列(contigs)使用的只需稍作修改默认设置为40 bp最低重叠和99%的身份(/)。单例对象(est不能组装在一起)和受到当地BlastX和BlastN分析对非冗余(nr)蛋白质和核苷