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使用一抗的直接 ELISA 实验方案 直接 ELISA 的一般程序和提示 缓冲液和试剂缓冲液和试剂：： 缓冲液和试剂缓冲液和试剂：： 碳酸氢盐/碳酸盐包被缓冲液 (100 mM) 应将抗原或抗体在包被缓冲液中稀释，从而将它们固定到孔上： 3.03 g Na2CO3 6.0 g NaHCO3 1000 ml 蒸馏水 pH 9.6 PBS：： ：： 1.16 g Na2HPO4 0.1 g KCl 0.1 g0.1 g K3PO4K3PO4 4.0 g NaCl （500 ml 蒸馏水）pH 7.4 封闭液封闭液：： 封闭液封闭液：： 常用的封闭剂为溶于 PBS 的 1% BSA、血清、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶。 洗涤液洗涤液：： 洗涤液洗涤液：： 通常为 PBS 或含洗涤剂例如 0.05% (v/v) Tween20 的Tris 缓冲生理盐水 (pH 7.4) (TBST)。 抗体稀释缓冲液抗体稀释缓冲液：： 抗体稀释缓冲液抗体稀释缓冲液：： 应在 1x 封闭液中稀释一抗和二抗，以降低非特异性结合。 一般程序： 将抗原包被到微孔板将抗原包被到微孔板 将抗原包被到微孔板将抗原包被到微孔板 1. 将抗原在 PBS 或其它碳酸盐缓冲液中稀释至 20 μg/ml 的最终浓度。移取 50 μl 抗原 稀释液到 PVC 微量滴定板的第一排微孔中，使该微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要 在微量滴定板上进行梯度稀释。 通常将含纯抗原的试样以低于 2 μg/ml 的浓度加到微量滴定板上。纯溶液不 是必需的，但是原则上，试样中超过 3% 的蛋白质应为靶蛋白 （抗原）。抗原 蛋白质浓度不应超过 20 μg/ml，因为这将使微量滴定板上的大部分可用位点 饱和。 使用一抗的直接 ELISA 实验方案 确保样品所含抗原的浓度在抗体检测范围内。 2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时，或在 4℃ 下孵育过夜。包被孵 育时间可能需要某些优化。 3. 弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200μl PBS。在水槽上方轻轻 甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。 封闭封闭 封闭封闭 4. 每孔添加 200μl 封闭缓冲液 （5% 脱脂奶粉/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位 点。替代封闭剂包括 BlockACE 或 BSA。 5. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 2 小时，或如更方便的话，则在 4 ℃ 下孵育过夜。 6. 用 PBS 洗涤微量滴定板两次。 用抗体孵育用抗体孵育 用抗体孵育用抗体孵育 7. 添加 100μl 抗体，其刚在使用前在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度 （依照制造商说明书）。 8. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。此孵育时间可能需要优化。2 小时通常足以获得强信号，但如若获得弱信号，则当在 4℃ 下孵育过夜时往往会观察到 更强的染色。 9. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。 检测检测 检测检测 10.使用多道移液器或多档移液器为每孔分配 100μl（或 50μl）底物溶液。 11.待显色充分后 （如有必要），将 100μl 终止液添加到微孔。 12.用酶标仪读取每孔的吸光度 （光密度）。 注意：某些酶底物被认为是有害的 （潜在致癌物），因此始终要小心处理并佩戴手套 。 数据分析： 由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在 X 轴 （对数标度）上，而吸光度标在 Y 轴 （线性标度）上通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。