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成骨细胞中 NO －C-FOS 通路对流体剪切力的响应 成骨细胞中 NO －C-FOS 通路对流体剪切力的响应 专 业： 口腔医学 博士研究生： 朱赴东 导 师： 赵士芳 教授 中文摘要 骨骼按遗传基因的调控建设骨骼的雏形，并在骨的生长发育中根据所承受载荷的需要对 自身不断地进行改建与重塑，以试图实现用最小的骨量达到最大的骨强度，这就是骨的功能 适应性。实验已证明，机械性应力应变是骨骼构建与重塑的基本动因。适宜的应力环境可以 促使骨代谢朝着最佳水平发展，反之则可导致不良后果。近年来，有关骨骼功能适应性机制 的研究在细胞生物学领域有了一些新的发现。研究证实，骨骼内的某些细胞能够感知生物物 理性信号(如力学信号、电信号等) ，加工整合这些信号．并将之转化为相应的骨骼结构变化。 细胞的这一功能被称为力学信号转导功能。这表明在骨骼的功能适应性机制中，力学现象与 骨骼的构建、重塑是通过细胞的功能性变化而直接联系起来的。 应力对骨的生长、吸收和重建起着调节作用。大量实验研究结果表明失重状态会导致骨 吸收增加，相反骨骼载荷的增加可以增加骨形成并降低骨吸收，这些在环境应力改变下引起 骨量的改变主要是通过成骨细胞系产生的。而在临床上无论是口腔正畸治疗通过在牙齿上施 加力的作用，使牙槽骨进行生物改建，还是牵张成骨术中骨组织和成骨细胞在术中受到牵引 力的作用，使骨组织得到拉伸等等都是机械信号作用于机体后最终转变为生物学效应的结 果。当成骨细胞受到外界机械信号后是如何将信号传导如胞内，如何相应地调节其生理功能 来适应外界的力学环境，对这些问题的研究将有助于进一步探索骨组织对外界力学环境的响 应，为骨组织工程和临床治疗提供新的理论依据。 本课题分为四个方面进行研究： - 2 - 成骨细胞中 NO －C-FOS 通路对流体剪切力的响应 第一部分 成骨细胞的培养及生物学特性研究 本研究为了获取的成骨细胞，并在探讨成骨细胞各种生物学特性后，为成骨细胞的进一 步研究和应用建立技术平台。我们取新生 1 天 SD 无菌级大鼠，在无菌取颅盖骨，利用 0.25% 胰蛋白酶以及 0.1% II 型胶原酶多次酶消化法进行成骨细胞原代培养，再进行反复传代。培 养的成骨细胞进行生物学特性鉴定，包括活体细胞倒置相差显微镜观察，HE 染色、光学观 察成骨细胞形态，碱性磷酸酶染色（ALP 染色），钙结节染色（Von-Kossa 染色）等。来验 证成骨细胞的形态、分化功能等特性。 结果显示，接种的细胞经 24 h 培养可贴壁，细胞呈三角形、纺棰形和多角形等多种形 态，胞浆向外伸展，并伸出突起。5 天后细胞数量增加，体积增大，细胞呈半融合状态。8 天后细胞融合成片，细胞呈指数生长。15 天后胞体膨大，细胞边界难以区分，并有聚集成 团现象，显示出集落样生长趋势。随着集落不断扩大，各集落间的外围细胞形态为短梭形、 三角形、多角形等多角形细胞有多个矢状突起，核卵圆形居一侧，细胞结节形成，基质堆积。 18 天后钙化结节形成。细胞融合后，进行 ALP 染色，大多数细胞出现阳性反应，可见细胞 膜及胞浆内颗粒均呈阳性反应。细胞形成钙化结节后，进行茜素红染色，可见结节呈红色。 以上结果表明，本项研究采用多次胶原酶消化的方法，使分离出的细胞具有数量多、纯 度高、24 h 内即可贴壁、镜下观察细胞形态完整且生长旺盛、成活率高等优点，是建立体外 培养大鼠成骨细胞实验模型的较好的方法。本实验获取的成骨细胞具有体内成骨细胞的多种 生物学特性，为观察研究成骨细胞体外的生长规律及其生物学特性，进而为进一步研究各种 调节因子对成骨细胞的作用，打下了良好的基础。 第二部分 用于体外培养成骨细胞的流体剪应力系统的 建立 机械力对细胞生物学行为的影响是目前细胞生物学和细胞力学研究的一个重要课题。细 胞力学是组织工程领域内的一个重要方面，而