腺病毒介导葡萄糖转运体3对大鼠PC12细胞缺氧-再灌注损伤基因治疗.pdfVIP

◇!。。热笔童 腺病毒介导的葡萄糖转运体3对大鼠PCI2细胞缺氧一再灌注损伤的基因治疗 腺病毒介导的葡萄糖转运体3对大鼠PCI2细胞缺氧．再灌注 损伤的基因治疗 中山大学附属第二医院神经外科 2003级硕士研究生 吴中华 导 师 李方成副教授 摘要 背景与目的：脑缺血一再灌注损伤是涉及众多方面的发生在不同时间、互相重叠、 互相联系的级联损伤反应。由于其发病机制的复杂性，目前临床治疗效果还不 理想，迫切需要探索新的治疗方法。新近的研究表明，能量代谢障碍在脑缺血引 起继发性脑损害中起非常重要的作用。由于脑组织本身无能量储备，而代谢旺盛 的特点决定了神经元细胞的能量供应主要来源于葡萄糖的有氧氧化。血液中的葡 萄糖进入神经元细胞内主要是通过葡萄糖转运体1(Glucosetransporter]，GL UTl)和葡萄糖转运体3(Glucosetransporter3，GLUT3)共同介导的。近年 来的研究表明，在大鼠局灶性脑缺血模型中，缺血半影区GLUTl和GLLUT3均有 表达上调，表明机体可能试图通过增加能量供应来减轻继发损害；体外实验也显 示在缺氧的情况下神经元细胞的葡萄糖转运体3的表达上调，同时提高细胞外环 境中的葡萄糖浓度可以有效的抑制细胞凋亡。基因治疗是近年来发展较快的一种 新的疾病治疗方法，载体是基因治疗最主要的制约因素，理想的载体应该是可以 将基因转移到特定的细胞或组织中，不引起免疫和炎症反应，不会引起潜在的基 因突变，而且基因的表达能得到有效的控制。目前用于基因治疗的载体都达不到 这种理想的要求，尤其对于中枢神经系统的基因治疗很难获得较为有效的基因转 染。单纯疱疹病毒(HSV)具有嗜神经性，但复制缺陷型HSV的生产过程中容易污 染野生型病毒。AAV可以将治疗基因整合到靶细胞的染色体上，表达时间较长， 但有可能发生基因突变，且病毒不易生产：腺病毒转染率高，宿主范围广，突变 的可能性低，易于生产，但机体容易产生免疫反应，而中枢神经系统是一个免疫 ◇妻；皇麓。芰 腺病毒介导的葡萄糖转运体3对太鼠PCI2刿胞缺氧一再灌注损伤的基因治疗 获免区。因此，腺病毒在脑缺血的基因治疗中会更有发展潜力，目前国外应用腺 病毒载体介导外源基因例如：神经生长因子(Nerve factor，NGF)，抗 growth fac 凋亡基因(bcl一2)，血管内皮生长因子(Vas—CU]arendothelial growth tor，VEGF)，抗炎基因(IL—lB)等对脑缺血缺氧干预的实验研究已有报道， 并取得了较好效果，而有关利用病毒载体介导外源性葡萄糖转运体表达对缺血缺 氧脑组织发挥保护作用的研究尚较少。基于以上的理论基础利研究现状，本实验 利用腺病毒载体介导外源性基凼葡萄糖转运体3(Glucosetransporter3，GLUT 情况及抗凋亡机制。 方法和结果：在眦K一293细胞内大量扩增腺病毒，浓缩，纯化并转染大鼠嗜铬 r 瘤细胞(PC]2)证明它具有感染活性利表达活性。携带绿色荧光蛋白(green luoresecent 的实验表明，腺病毒对PCI2细胞有较高的转染率，而且毒性较低。在建立大鼠 嗜铬瘤细胞(PC]2)缺氧一再灌注氧损伤模型的基础上，使用AdGLUT3转染Pc 12细胞，流式细胞仪法和TUNEL法进行凋亡分析显示，Ad—GLU113转染组的凋亡 率较对照组明显降低(P(O．05)，使用同位素放射的方式分析葡萄糖代谢情况， Ad—GI。UT3转染组的葡萄糖吸收率较对照组明显提高(PO．05)。本实验也使用we stern—Blot方法进行了细胞凋亡相关蛋白的检测，结果显示Ad—GLUT3转染组 factor 较对照组，缺氧诱导因子一la(hypoxi