水稻精细胞基因RSSG58启动子克隆分析及表达载体构建.pdfVIP

维普资讯 2003年 02月 四川大学学报 (自然科学版) Feb．2003 第40卷第 1期 JournalofSichuanUniversity(NaturalScienceEdition) Vo1．40 NO．1 文章编号：0490—6756(2003)01—0153—06 水稻精细胞基因RSSG58启动子的 克隆分析及表达载体构建 苗琛 2，兰利琼 鲍锦库 ，唐琳 ，徐莺 ，王胜华 ，陈放l’ (1．四川大学生命科学学院，成都610064；2．河南大学生命科学学院，河南开封 475001) 摘 要：根据公布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基 因cDNA序 列，以水稻品种 “桂朝 2号”黄化苗基 因组 DNA为模板 ，用 PCR方法克隆出RSSG58在起始密 码子以前的上游调控序列Pr58．经对 Pr58启动子进行的鉴定和分析表明，具备大多数高等植 物启动子的保守元件，预计它对 RSSG58基因在的特异表达方面具有一定的作用．为了鉴定 RSSG58基 因的基本启动子元件 ，将 RSSG58基 因5侧翼序列做缺失片段分析 ，由PCR从 Pr58中得到 3个不同大小两端带有 Hind ItI，BamH I酶切位点的片段 Pr58I，Pr58II和 Pr58III，定向插入载体pMGFP4(pBI221改建，报告基因为GFP)中，取代原有的CaMV35S启 动子，构建了由驱动报告基因GFP的植物表达载体 pRGFPI，pRGFPII和 pRGFP11I，用于农 杆菌介导法水稻遗传转化．其 目的是为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定基础． 关键词：启动子；水稻；RSSG58基因；表达载体；绿色荧光蛋 白 中图分类号 ：Q812 文献标识号：A 在近十几年来，不少学者已开展了植物雄性不育分子机制的研究及其基因工程研究 J．该领域研究 的关键在于能否获得雄性不育和恢复基因，而这些基因的表达需要发生在花药花粉发育时期 ，这就要求其基 因的启动子在花药花粉发育时期中具有特异的时空表达性．花粉中的精细胞在植物生殖过程中担负着受精、 识别 、遗传物质传递等重要使命，受精作用机制的认识，例如精子异型性、配子识别以及卵活化的信号传导， 必定有一系列特异基因调控，对这些调控基因的结构与功能的研究是了解植物双受精机制的关键之一．因 此，从分子水平上彻底弄清植物开花及受精过程的基因表达调控机制，将逐渐成为国际植物分子生物学界的 研究热点．植物基因的表达是以一定的时间和空间顺序进行调控的，有时只在某种细胞的特异发育阶段表 达，有时则只在细胞受到某种环境刺激后才能表达．近几年来，有关高等植物基因调控的研究不断深入，主要 集中在种子蛋白基因、光调控基因、激素诱导基因、环境伤害等诱导基因及其它一些相关基因上 ¨．研究 发现，启动子作为一种基因表达的顺式作用元件 ，在植物基因调控中扮演着十分重要的角色． 水稻是植物发育生物学和分子生物学研究的模式植物，水稻基因组测序工作的完成促进了对水稻功能 基因的研究 ．我们已成功地分离出了批量的生活精细胞，并用抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHy— bridization，SSH)技术从水稻精细胞文库中，筛选到一些在精细胞中优势表达的基因 1【2,13J．其中RSSG58基 因在精细胞中的优势表达，可推测蛋白与拟南芥肌球重链蛋白的同源性较高，肌球蛋白在高等植物生殖发育 过程中具有重要的作用 引．为了深人研究RSSG58基因在精细胞中的时空表达及功能作用，我们对RSSG58 基因上游的启动子进行克隆及功能元件分析．在此基础上，构建了一个较为可行的缺失片段表达载体，从而 为深入研究这一基因启动子在启动植物生殖过程中细胞的特异基因表达奠定基础． 收稿 日期：2002—09—02 基金项 目：国家 自然科学基金 ，教育部博士点基金 ，四川省重点科研项 目基金 *通讯作者，E—mail： chenfang@8121．1．edu．cn