翻译：MtPAR MYB转录因子作为一个开关参与苜蓿原花色素合成.docVIP

MtPAR MYB转录因子作为一个开关参与苜蓿原花色素Pa，儿茶素，表儿茶素是对人体健康有益的抗氧化剂，包括保护心脏，抗癌，消炎。牧草植物中的Pa与蛋白结合，减慢在反刍动物的瘤胃的发酵，降低了微生物产生的甲烷含量，从而使动物免受可能致死的气胀病的危害。牧草植物中等水平的pa含量，可以改善氮素营养，减少尿氮排泄，有利于抵抗肠道寄生虫。不幸的是，很多豆科植物，包括世界上最重要的牧草植物，紫花苜蓿，没有足够多的pa来抵抗食草动物的胀气病。因此，提高苜蓿和其他饲料豆科植物根中pa含量成为生物技术的一个重要目标。 Pa的合成和调控在非豆科植物的模式植物拟南芥中已研究清楚。拟南芥中pa的合成知识大部分来自于tt突变体，表现为种子色素沉着较少。20个tt基因已被鉴定，它们编码参与pa合成及储存或者调控pa产量的蛋白的酶或者转运子。转运子包括一系列的转录因子：tt2，myb家族的转录因子；tt8， bHLH转录因子；ttg1，WD40蛋白，共同组成一个调控花色素还原酶转录的三聚体。 最近，已经从模式豆科植物苜蓿中分离和鉴定了参与pa合成的几个关键的基因/酶和一个转运子的前体。然而，我们对苜蓿和其他豆科植物pa的生物合成知之甚少，，只有一个WD40重复结构的转录因子有牵连，在紫花苜蓿种子的正调控pa的合成。 苜蓿的全基因组转录因子研究和其他在种子发育过程中被激活的基因中，锁定了超过30个诱导种子的转录因子用于反向遗传学功能鉴定。其中一个编码调控苜蓿种子pa合成的myb蛋白家族的转录因子。这个基因在转基因毛状根的异常表达导致pa合成和积累。因此，这个myb转录因子具有提高牧草单宁水平的潜力。 结论： MtPAR编码一个在种皮中特异表达的myb转录因子 图1：MtPAR基因的表达。MtPAR在种子发育不同阶段和在种子不同组织中的表达情况。 我们使用了苜蓿的基因表达谱来筛选诱导种子的转录因子基因用于遗传鉴定。其中之一，MtPAR，编码一个假定的R2R3类的myb转录因子，基于其蛋白N末端高度保守的R2和R3 myb DNA结合结构域。MtPAR仅在种子中表达，授粉后24天表达量最高。定量rt-pcr表明这个基因在种皮中特异表达，在胚和成熟种子的胚乳中不表达。距离分析，没有发现MtPAR和参与花青素或者pa合成的myb转录因子之间有密切联系。最接近同源的MtPAR是大豆里一个功能未知的myb蛋白。 Par突变体在种皮pa积累中是有缺陷的 我们通过转座子插入MtPAR基因分离了四个独立的突变体。群体中在NF4419的第二个外显子中，NF2466，NF1358，NF3308的第三个外显子中发现了Tnt-1插入。与野生型相比，这四个插入突变体分离得到的纯合株系的成熟种子色素沉着减少。在发育种子中，四个突变体的MtPAR转录水平不到野生型的5%。 图2：苜蓿par突变体分析 A：不同的Tnt-1插入MtPAR的位置和相应的突变体株系的名称。线表示内含子，矩形表示外显子。 B： NF4419突变体株系中突变对种子色素沉着的影响。在另一个突变体株系中也观察到了相似的表型变化。 C：NF2466突变体株系成熟种子的dmaca染色 D：提取物中pa水平（可溶的和不可溶的）与各自相应的对照。 Dmaca染色表明，与野生型相比，突变体的成熟种子中pa含量降低。发育种子的Dmaca染色表明，在授粉后10天到16天中，突变体和野生型pa含量都呈现出相似的，逐渐积累。授粉后20-24天，突变体和野生型之间的差异开始明显，这个现象与野生型的MtPAR在授粉后24天后表达量最高相一致。电镜观察突变体和野生型种子dmaca染色的横切面，很大程度上局限在种皮，表明MtPAR表达的组织特异性。par突变体种子的可溶解的和不可溶解的pa水平都低于各自的对照，突变体可溶解的pa含量比对照低50%，不溶解的pa含量比对照低80%。高效液相色谱分析表明，par突变体和野生型的各种pa二聚体分布相似。花青素的分光光度分析表明，par突变体和野生型种子没有明显差异。结论，MtPAR调控的是种子中pa，而不是花青素。 MtPAR异常表达诱导pa合成 图3：在苜蓿毛状根中过表达MtPAR A：过表达MtPAR转化株的毛状根的表型。左：gfp作为转化标记。中和右：dmaca未染色和染色的毛状根 B：在14个不停毛状根转化体中可溶pa和花青素浓度与MtPAR表达水平的相关。 为了探究MtPAR在pa合成中的作用，我们使用了组成型表达启动子35S结合MtPAR的cDNA来转化苜蓿的毛状根。利用土壤农杆菌来转化含有使转化的毛状根可见的gfp标记和 p35S:: Mt PAR载体到苜蓿中。通过qRT-PCR检测苜蓿毛状根中MtPAR的异常表达。观察最初的未染色的毛状根发现，与转化p35S::GUS的毛状根相比，p