根际及内生菌控制小桐子XXX病害的初步研究实验方案.docVIP

根际及内生菌控制小桐子XXX病害的初步研究 1 材料 1.1供试作物及病原菌 材料：小桐子 小桐子病原菌：(由……..提供) 1.2 培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂18 g、水1000 mL、调节PH 7.2—7.4。（斜面及平板培养） 在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2～7.,转入锥形瓶用高压蒸汽灭菌30分钟。α-萘胺0.1g，蒸馏水20ml，稀醋酸（10%左右）150ml 方法 2.1 分离培养基的选择 取小桐子组织，表面消毒后无菌剪刀剪碎，置于灭菌的研钵中，加入一定量无菌水，研磨，各取1mL的液体，10倍递减稀释分别涂布LB、NA平板，于28℃下培养24 h，计数，计算出在不同培养基上的菌落形成单位（CFU/ g），同时，比较不同培养基平板上长出的菌落类型。根据不同培养基上的菌落数和菌落类型，选择最佳的分离培养基。 2.2 小桐子内生细菌的分离纯化 内生菌分离：用组织破碎分离法，取小桐子组织经自来水反复冲洗后，用无菌水冲洗4～5次，用70 ％ 酒精浸洗5 min，分别用2 ％ 次氯酸钠消毒8、10、12、14、16、18 min，无菌水冲洗4～5次，取最后一次无菌水冲洗液涂抹NA平板，进行无菌检验，筛选次氯酸钠的最佳消毒时间。取灭菌彻底的各种组织置于无菌研钵中加入10mL 磷酸盐（PBS，pH 6.8）后研磨，静置5分钟。取上清液进行十倍递减稀释，取10-1、10-2、10-3三个浓度涂抹NA平板，0.1 mL／平板，重复三次。接种后的平板置于26～28 ℃培养2～3 d，计数。 纯化：划线培养，根据菌落的形态，颜色，大小等形态特征挑取培养特征相异的单个菌落，反复划线纯化培养后，挑单菌落移入试管斜面保存。即用灭菌的接种环沾取材料在平板的一边做第一次“Z”划线，转动70。角，将接种环在酒精灯上烧过并冷却后，通过第一次划线部分做第二次划线，同法，划第三次。接种好后26~28度倒置培养，划线培养，直至得到纯培养体。低温保存备用。 2.3 对病原真菌有拮抗作用的内生细菌的筛选测定 在 100 mL熔解后冷却至 45℃ 左右的 NA培养基中加入 1 mL病原细菌菌液,混匀后制成含菌平板 ,然后在每个平板上均匀的接种内生菌株 ,培养 24 h后测定抑菌透明圈的大小。对真菌的拮抗测定:在 PDA平板中央接入直径为 5 mm的病菌菌块 ,用对峙法每平板接种 3个培养 24～48 h的活性菌株进行拮抗菌真的筛选 ,26℃ 下培养 48～96 h,观察抑菌带的有无。以无菌水代替内生细菌菌液接种处理为对照，26～28 ℃培养3 d后，观察是否有抑菌圈产生，当对照病原菌长至培养皿边缘时测病原菌菌落直径，计算相对抑菌率，每菌株重复三次。 将筛选出的具有拮抗作用的内生菌与供试病原菌对峙培养，2菌相距3cm，根据病菌菌丝生长的速率及菌落大小测定抑菌率的强弱，重复 3 次。以无菌水代替内生细菌菌液接种处理为对照。 相对抑制百分率=（对照菌落直径–处理菌落直径）／（对照组菌落直径 –菌饼直径）×100 ％ 2.4 活性物初步测定 筛选到拮抗性细菌后，尽快比较各菌株的拮抗能力，并选择高拮抗菌株进行发酵培养基 黄豆粉10g，甘露醇10g，水1L，pH7.0～7.5、过滤，用滤液浸泡灭菌纸片，然后放在接有病原菌的培养皿中；同时破碎菌体反复冻融法: 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。并灭菌——这一步检查具有拮抗病原菌的活性物质是胞外分泌成分还是胞内成分，并比较两者的活性7%、10%的LB液体培养基中加入1％的培养16 h的细菌发酵液，28℃培养3-7天，与未接种的对照管对比，观察其生长情况。 接触酶：将待测定的细菌在NA平板上培养24h，用接种针挑取一些细菌涂布在干净的载玻片上，加一滴3％的H2O2，观察结果。有气泡产生者为阳性反应，无气泡产生则为阴性反应。 硝酸盐还原试验： 培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，KNO3 1g，蒸馏水1000mL，pH7.0；将细菌接种在硝酸盐培养液中，做不接种的对照管，适温培养1、3、5d后，取少许的培养液放入到干燥的试管中，按顺序滴入格里斯氏试剂，在对照管中同样加试剂，如果溶液变粉红、玫瑰红或者橙色，则表示有亚硝酸盐的存在，为硝酸盐还原阳性，反之为阴性。如无红色出现，则可加1-2滴二苯胺试剂，此时培养液如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐。 生长温度的测定：在LB液体培养基中加入1％的培养16h的细菌发酵液