三疣梭子蟹血细胞群间基因表达差异研究技术的探索【毕业论文】.doc

本科毕业论文 （20 届） 三疣梭子蟹血细胞群间基因表达差异研究技术的探索 专业：生物科学 目录 摘要 I Abstract II 引言 1 1. 材料与方法 2 1.1 材料 2 1.2 试剂及仪器 2 1.2.1 实验试剂 2 1.2.2仪器 2 1.3 免疫相关基因及引物 2 1.4 试验步骤 3 1.4.1 三疣梭子蟹血细胞群的分离 3 1.4.2 三疣梭子蟹免疫相关基因cDNA的扩增 4 1.4.3 三疣梭子蟹免疫相关基因gDNA片段的PCR扩增与测序 6 1.4.4 三疣梭子蟹甲醛固定血细胞免疫相关基因的RT-PCR 10 1.4.5 研究中所用分子生物学分析软件 11 2. 结果 12 2.1 三疣梭子蟹免疫相关基因cDNA的扩增 12 2.1.1 总RNA的提取 12 2.1.2 免疫相关基因RT-PCR的扩增 12 2.2 三疣梭子蟹免疫相关基因gDNA的扩增 13 2.2.1 三疣梭子蟹gDNA的提取 14 2.2.2三疣梭子蟹免疫相关基因gDNA的扩增 14 2.3三疣梭子蟹血细胞群的分离 15 2.4 三疣梭子蟹甲醛固定血细胞免疫相关基因的RT-PCR 15 3. 讨论 17 3.1 三疣梭子蟹血细胞群的分离 17 3.2 甲醛固定细胞RNA的提取与RT-PCR扩增 17 参考文献 18 致谢 20 摘要 [摘要] 甲壳动物缺乏特异性免疫，其免疫防御主要依赖于血细胞的吞噬、包囊以及血淋巴中的一些酶和免疫因子的抗菌、杀菌作用来完成。一般认为甲壳动物血细胞由颗粒细胞、半颗粒细胞及透明细胞三类组成。但不同类型血细胞功能及参与的免疫防御反应目前还不是很清楚。本研究的目的在于建立一种研究方法，使之可用于研究免疫相关基因在三疣梭子蟹不同细胞群中的表达差异，为探索免疫相关基因及不同类型血细胞的功能奠定基础。 通过甲醛固定、不连续密度梯度percoll离心技术解决了三疣梭子蟹血细胞不同细胞群的分离问题；通过实验摸索，解决了以甲醛固定细胞裂解液直接作为RT-PCR模板问题；已筛选出1个没有DNA扩增干扰、可作为半定量RT-PCR内参基因和4个可设计跨内含子引物的功能基因。为后续完成三疣梭子蟹血细胞免疫相关基因表达差异研究技术的建立奠定了基础。三疣梭子蟹血细胞免疫相关基因表达差异Abstract [Abstract] Crustaceans is lack of specific immune system, its immune defense depends on the phagocytizing actions of blood cells, cysts and the antimicrobial functions of enzymes and immune factors of hemolymph. Crustaceans blood cells are generally believed to be composed of granular cells, semi-granular cells and hyaline cells. However, the functions of different types of blood cells and responses to immune defense involved are not yet clear. The purpose of this study is to establish a research method that can be used to study the immune-related genes expression diversity in different cell populations of Portunus trituberculatus to lay the foundation for the exploration of different types of immune-related genes also functions of blood cells. Using formaldehyde fixation, discontinuous percoll density gradient centrifugation solved the separation problem of P. trituberculatus blood cells from different cell populations；formaldehyde fixed cell lysate directly as RT-PCR template; Has selected a primer can