模式植物拟南芥T-DNA插入突变体鉴定.pptVIP

实验材料 拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传 学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物， 其原因主要基于该植物具有以下特点： 植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 　　 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右； 种子多，每株每代可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培 养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯 合，用理化因素处理突变率很高，容 易获得各种代谢功能的缺陷型。 突变体的获得 插入诱变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插 入到拟南芥基因组中，获得突变体。 当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。 农杆菌转化法： Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农 杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA 中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。根据这一现象， 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，可通过农杆菌 侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 模式植物拟南芥 拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。 现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基因被关闭的拟南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。 AT1G69120基因 AT1G69120基因即APETALA1，已有实验证明AT1G69120是拟南芥花分生组织特征基因。 研究AT1G69120在花发育中的网络调控及其生物学功能。 获得插入T-DNA的APETALA1突变体。 利用反向遗传学方法进行研究。 通过对突变体的突变性状与野生型拟南芥生长发育以及生理特征进行比较，可以获得拟南芥AT1G69120基因影响生物生理功能的相关信息。 拟南芥突变体的获得 打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下： 在上面的search内查找 基因名称APETALA1： 从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟 南芥中的，点击AP1： 根据上面的信息我们可以 得到基因在拟南芥内的系 统名称：AT1G69120 查找基因AT1G69120 打开SALK主页： http://signal.salk. edu/ 打开的页面如下： 点击T-DNA Express： 输入基因名称 AT1G69120，点击 search： 查找基因AT1G69120 从上述窗口中可以获得很多 不同的突变体，专找 SALK_冠名的那些，获得 比较方便且便宜，有利于插 入突变体。比如选择的是 SALK_151561.52.85.n 点击上面红圆圈内的 SALK_151561.52.85.n 可以从上面找到T-DNA的 侧翼序列、所有的载体序列 以及订购方式等。 查找种子 打开 NASChttp://www. / 打开的页面如下： 输入上面选择的 SALK_151561.52. 85.n，寻找合适的种子 序号：N57925 突变体引物查询 进入SIGnAL网站 http://signal.salk. edu/ 打开的页面如下： 点击iSect Tools进入: 点击第一个选项 1、?SIGnAL T-DNA Verification Primer Design进入 突变体引物查询 在这个网页里可以从上面的一 些文字得到常用中间引物的序 列，在下面的输入框里输入 SALK_151561.52.85.n号 后，即可得到左侧和右侧的引 物： Company Logo LOGO 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 2012.11.28 1 2012.11.28 目录 拟南芥的栽培 拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定 实验设计思路和原理 2 2012.11.28 实验设计的思路和原理 经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发