超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定饲料中九种雄性激.docVIP

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定饲料中九种雄性激素类药物 张 峰1 许成保1,2 蓝 芳3 王秀娟1 雍 炜1 锁 然2 储晓刚1* 丁 菲1,4 吕泉福1,5 1（中国检验检疫科学研究院，北京100123）（浙江中医药大学，杭州310053（西南大学，重庆 400715摘 要 建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析动物饲料中违禁添加的去氢睾酮 BOL 、表睾酮 epiAn 、氟甲睾酮 FT 、去氢甲睾酮 美雄酮 MD 、甲睾酮 MT 、丙酸诺龙 NP 、诺龙 N 、丙酸睾酮 TP 睾酮 T 种药物的分析方法。样品经乙酸乙酯振荡提取，再用基质固相萃取方法净化处理后，采用UPLC-Q-TOF-MS分析检测。在电喷雾正离子模式和飞行时间模式下，输入各化合物的精确分子离子质量数得到相应的提取离子色谱图，以色谱峰面积进行定量分析。通过碰撞诱导解离模式（CID）得到各化合物碎片离子的精确质荷比，进一步对各化合物进行定性。各化合物的质量精确度均小于5 ppm，9种化合物在0 ~ 1 μg/L 范围内均呈良好的线性关系，线性系数均大于0.99。去氢甲睾酮本方法μg/L；去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮 美雄酮 、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮睾酮的定量限（LOQ）分别为16﹑10、20、43、20﹑12﹑15﹑10g和16 μg/kg。个添加水平（LOQ、2LOQ、4LOQ）的回收实验表明，化合物的回收率在70.0～99.7%范围内，相对标准偏差 RSD 均10%。本方法可用于饲料中的禁用雄性激素药物的测定。 雄性激素是一类生物体内产生的调节机体代谢或生理功能的物质，在养殖业中用于促进动物生长、提高蛋白转化率，以达到大幅度提高动物养殖经济效益的目的。研究表明，雄性激素药物可通过饲料进入到动物组织，被人体摄入后，残留的雄性激素会干扰人体内自然激素的平衡，引起妇女出现类似早孕的反应以及乳房肿胀、不规则出血等，影响肝脏功能，导致新生儿畸形，并且使人体患癌症的几率大大提高。因此，欧盟95/22/EC 规定禁止在饲料中使用雄性激素药物，我国也颁布了相关的法律禁止在饲料中使用雄性激素药物，但是违规使用的案例仍时有出现，所以发展一种快速、准确的检测方法显得很有必要。 常用的雄性激素的检测方法包括酶联免疫分析法（ELISA）[]、气相色谱法 GC []、气相色谱质谱法（GC-MS）[]、液相色谱法 HPLC []、液相色谱质谱法 LC-MS []和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）[111]等。ELISA、GC和HPLC的方法灵敏度较低, 选择性和特异性较差, 已经不适于雄性激素痕量残留分析的要求。GC-MS、LC-MS和LC-MS/MS虽然方法灵敏度和特异性都比较高, 但是，由于难以完全阐明化合物的结构裂解信息，定性准确度方面尚有欠缺。四极杆-飞行时间质谱 Q-TOF 技术可对化合物进行精确分子质量的测定，并依据所测得的化合物的精确分子质量对其进行确证分析，同时在碰撞诱导解离（CID）模式下，得到化合物及其碎片离子的分子式和精确分子质量，可进一步对化合物的结构和裂解规律加以确证，定性准确性高。目前尚未有应用Q-TOF分析雄性激素的文献报道。 本采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术，建立了动物饲料中雄性激素的分析方法。优化了前处理方法和色谱质谱条件，建立了动物饲料中去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮 美雄酮 、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮和睾酮违禁添加的雄性激素方法。 实验部分 仪器与试剂 ACQUIT Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪, Synapt Q/TOF四极杆/飞行时间质谱仪 Waters公司 ；均质器；超声器；振荡器；离心机；旋转蒸发仪。 甲醇乙酸乙酯（HPLC级, Fisher科技公司）；甲酸；N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）十八烷基键合硅胶吸附剂（C18-封端，粒径范围为4060 μm，100 ?平均孔径博纳艾杰尔科技有限公司；无水（分析纯）500 ℃灼烧4 h，置于干燥器中备用；种雄性激素去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮和睾酮标准品均购于igma公司；实验用水均为超纯水 Millipore公司 。 称取饲料试样2 g 精确到0.01 g ，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL水高速均质1 min，水浴超声5 min，取出样品静置使其温度降至室温。加入15 mL乙酸乙酯，水平振荡提取10 min，于5℃，10000 r/min离心5 min。收集上清液于另一50 mL具塞离心管中。剩余混合物中分两次分别加入15和10 mL乙酸乙酯，重复振荡提取和离心，合并3次上清液于离心管中从中移取10 mL