实时荧光定量PCR技术在出入境佥验检疫中的应用研究进展（连载）.pdfVIP

科 学 论 坛 实时荧光定量PCR技术在出入境 检验检疫中的应用研究进展 连载 薛银刚 陈 军 宋 白薇 石建华 鞠慧萍 郑 晨 苏州出入境检验检疫局 江苏 苏州 215104 [摘 要]实时荧光定量PcR是一种将核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起的新技术。由于其检测速度快，且灵敏性 高、特异性好、定量准确而被广泛应用于食品中致病微生物的检测。本文主要从食品致病菌、植物病害和动物疫病三方面来总结实时荧光 定量PCR在出入境检验检疫中的应用研究进展。 [关键词]实时荧光定量PCR 检验检疫 研究 进展 中图分类号：TB 文献标识码：A 文章编号：1009-914x 2010 02一O017一O1 PCR，全称聚合酶链式反应是一种DNA体外扩增技术。自l985 中毒事件 日见增多，已引起国内外的广泛关注。翁文川等 2005 根 年问世以来，该技术迅速被广泛应用于各种基础研究和生物特异性基 据单增李斯特菌溶素A基因hlyA基因，设计了特异引物和TaqMan探 因检测，特别在生物特异基因检测、有害生物鉴定等方面得到了广泛 针并优化体系，建立了荧光PCR检测单增李斯特菌的方法，该方法检 的应用 侯宇，2009 。但是传统的PCR在应用时存在很多局限性，如 测底限为lcfu／g，整个流程只需27h。熊国华等 2007 也根据hlyA 出现假阳性、EB染色对操作者的危害及环境的污染、不能准确定量等。 基因设计引物和探针，并用该引物和探针运用RTQ—PCR技术对单增李 因此为了克服这些缺陷，实时荧光定量PCR应运而生，实时荧光定量 斯特菌的DNA、细胞、质粒和样品进行定量检测，建立了DNA校正曲 PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时 线、细胞校正曲线和质粒校正曲线，三种校正曲线检测样品得出的结果 监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 基本吻合。该方法灵敏度高、特异性好、准确，可应用于食品中单增 法。根据荧光类型，它可分为引物标记、染料类和探针类三种。引物 李斯特菌的检测。刘仲敏等 2007 也建立了灵敏度高、特异性好的实 标记是直接对引物进行荧光标记从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩 时荧光PCR定量方法，可应用于食品中单增李斯特菌的检测。 增产物的方法；染料类是利用特定染料与 dsDNA小沟结合发出荧光， 1．3产肠毒素大肠埃希菌 利用荧光强度来计算扩增产物的增加；探针类是利用能与靶序列特异 产肠毒素大肠埃希菌 ETEC 是传染性腹泻的主要原因之一。代娟 杂交的探针来指示扩增产物的增加 蔡霞，2005 。 等 2008 针对编码大肠埃希菌sTI、LTI基因片段设计引物和探针， 荧光定量PCR技术 由于其特异好、灵敏度高、快速简便和可定量 建立了RTQ—PCR检测方法。通过进一步完善，有望成为获得国际认可 性等特点，被认为是一项具有革命性的技术，目前已被广泛应用于出 的检测产肠毒素大肠埃希菌的最理想的标准方法。周微等 2009 利用 入境检验检疫中，本文主要分成食品致病菌、植物病害和动物疫病中 SYBRGreenI荧光定量PCR技术建立了快速检测原料乳中大肠杆菌 的早期诊断三部分分别进行综述 。 数量的方法。徐德顺等 20O9 针对大肠杆菌O ：H 的特异性基因 一 实时荧光定量PCR技术在食品致病微生物早期诊断中的应用 rfbE基因设计引物和探针，优化该菌的TaqMan PCR反应条件，建 食源性致病菌导致的食品安全事件频频发生，据WHO统计，发达 立了大肠杆菌0一 ：H 实时荧光PcR检测方法。 国家每年约有三分之一的人感染食源性疾病，美国每年的食源性疾病 1．4金黄色葡萄球菌 多达7600万例。而在一些发展中国家，食源性疾病往往是导致人的非 金黄色葡萄球菌 Staphy1OCOCCUSaureus 是引发多种类型感 正常死亡的主要原因，全世界每年有2