Nesprin蛋白对骨髓间充质干细胞的影响.pdfVIP

• 408 • 中国胸心血管外科临床杂志 2012年8月第 19卷第4期 Chin J Clin Thorac Cardiovasc Surg, August 2012, Vol. 19, No. 4 • 论著 基础研究 Nesprin 蛋白对骨髓间充质干细胞的影响 杨文钢  薛松  连锋  汪永义  胡振雷  朱洪生  （上海交通大学医学院附属仁济医院 心血管外科， 上海 200127） 摘要：  目的 构建 nesprin 蛋白 siRNA 慢病毒载体（LV-siNesprin ），感染骨髓间充质干细胞（MSCs ），观察nesprin 蛋白对 MSCs 的影响。 方法 针对 nesprin 靶基因序列设计并合成 4 对 miRNA oligo ，并将 4 对 oligo 退火成 双链 DNA ，测序鉴定。将 4 种 miRNA 干扰质粒（SR-1、SR-2、SR-3、SR-4 ）转入大鼠血管平滑肌细胞，用反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR ）和蛋白印迹法（Western blotting ）检测干扰效应，筛选最佳干扰序列；将最佳干扰序列 和 pDONR221 载体进行重组反应，获得含干扰序列的入门载体，再将入门载体和慢病毒表达的目的载体 pLenti6/ V5-DEST 进行重组反应获得含干扰序列的 LV-siNesprin ＋绿色荧光蛋白（GFP ），包装慢病毒，测定病毒滴度。 LV-siNesprin ＋GFP 转染 MSCs ，Western blotting 鉴定比较 nesprin 蛋白表达情况（分为 LV-siNesprin ＋GFP 组、 GFP 对照组和正常细胞组），用 4，6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI ）染色观察细胞核形态改变和四甲基偶氮唑盐 （MTT ）法检测MSCs 感染 LV-siNesprin 后 24 h、48 h 、72 h 和 96 h 的增殖情况（分为 LV-siNesprin ＋GFP 组、GFP 对照组和正常细胞组）。 结果 测序证实合成的 4 对 miRNA oligo 正确，RT-PCR 和 Western blotting 筛选出最佳 6 干扰 miRNA 质粒 SR-3 ，成功构建 LV-siNesprin ，包装慢病毒，病毒悬液的活性滴度为 1×10 ifu/ml 。LV-siNesprin 转 染 MSCs 后，nesprin 蛋白表达明显下降，出现细胞核融合、核碎裂等形态学改变；MTT 法检测显示，LV-siNesprin ＋ GFP 组 MSCs 增殖速度较 GFP 对照组和正常细胞组减慢。 结论 Nesprin 蛋白对 MSCs 核膜稳定维持核膜空间 结构起作用，并利于细胞增殖更新。 关键词： Nesprin 蛋白； 骨髓间充质干细胞； 细胞增殖； 慢病毒载体 中图分类号： Q813.1＋1 文献标识码： A 文章编号： 1007-4848 （2012 ）04-0408-06 Experiment of Nesprin Protein Influence on Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells YANG Wen-gang, XUE Song , LIAN Feng , WANG Yong-yi , HU Zhen-lei, ZHU Hong-sheng. （Department of Cardiovascular Surgery ,