马铃薯茎尖超低温保存技术研究.pdfVIP

马铃薯茎尖的超低温保存技术研究 万学玲 甘肃农业大学生命科学技术学院， 甘肃兰州（730070 ） E-mail ：xuelingwan@ 摘 要：以马铃薯甘农薯1 号试管苗的离体茎尖为实验材料，采用玻璃化法对其超低温保存 技术进行了研究。将马铃薯茎尖用玻璃化溶液PVS2 预处理30 min ，在冷冻管中换上新鲜的 PVS2 ，投入液氮冷冻5 min 和10 min，在37℃水浴中解冻2 min ，用1.2 mol/L 蔗糖液体培 养基洗涤2 次，每次10 min，然后接种到4 种添加了不同激素的MS 培养基上，在室温下进 行恢复培养，培养 10 d 后，其成活率最高可达40%。从前处理、冷冻保护剂、化冻方式、 马铃薯茎尖在液氮中保存时间长短、生长调节物质的种类和浓度等几个方面讨论了存活率的 影响因素及操作关键技术，并对玻璃化法超低温保存的应用前景作了展望。 关键词：马铃薯；茎尖培养；玻璃化；超低温保存；存活率 1. 前言 超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的理想方法。在超低温条件（一般指液氮 低温，-196℃）下几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止进行，而细胞活力和形态发生 的潜能可保存，这样植物材料处于相对稳定的生物学状态，从而可以达到长期保存种质的目 的[1] 。自从1973 年Nag 等首次成功地超低温保存了胡萝卜悬浮细胞以来，国内外已对近200 种植物材料进行了超低温保存[2]，所采用的方法主要包括两步法、玻璃化法和包埋-脱水法。 其中玻璃化法是20 世纪80 年代才发展起来并日益受到广泛重视的超低温保存新技术。所谓 “玻璃化”就是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液 中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度，而被固化成玻璃 态（或非晶态），并以这种玻璃态在低温下保存[3] 。溶液在降温时，如果缺乏均一晶核生长 条件或生长所需的足够时间，就首先成为过冷的溶液，它是低于冰点而不结冰的液态。继续 降温，均一晶核开始形成，此时的温度称为均一晶核形成温度，也称为过冷点。继续降温过 程中如果降温速度不够快，则在保存的植物材料中形成尖锐的冰晶；若快速降温，植物材料 中的均一晶核就很少或几乎没有形成，溶液就进入一种无定型的玻璃化状态。此状态下既没 有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶对细胞的损伤，因而植物材料的存活率大大提高。依 此原理进行的保存方法称作玻璃化超低温保存[4] 。 玻璃化超低温保存作为一种植物种质保存技术中理想的方法，与传统的超低温保存方法 相比，设备要求简单，处理步骤简便，效果和重演性好，避免了一些种质的冷敏感问题，并 且在复杂的组织和器官的超低温保存方面有较好的应用潜力，倍受人们推崇。随着园艺产业 的不断发展，种质资源的重要性越来越被重视。传统的种质资源保存方法即原境保存或在异 境建立田间种质基因库及种子库的缺陷日益明显。首先，这种方法需要大量的土地和人力资 源，管理费用也较高；其次，在此过程中易遭受自然灾害的影响，从而发生自然变异和种质 退化，影响种质的遗传稳定性[4] 。而超低温保存技术则克服了这些不足，显示了其广阔的前 景，为种质在国际间的交换提供了更为理想的途径。而玻璃化以其设备简单和操作程序简单 等优点更是倍受青睐。自从玻璃化法问世以来，该方法在冻存各种植物茎尖中取得了很大进 展，尤其是近几年更是从成活后检测等角度作了深层次的研究，使该种方法不断的趋于完善。 茎尖是园艺植物品种改良,快速繁殖和脱毒繁殖的重要手段。而且茎尖分生组织细胞分 化程度小,在植物保存后的再生过程中比其它细胞培养物的遗传性相对稳定[5],所以茎尖分生 - 1 - 组织是超低温保存的一种理想材料。 要成功地进行超低温保存，选择在最适生长阶段的材料是很重要的。茎尖细胞的生长年 龄和抗冻性的提高有密切关系，而且也是决定冻存后细胞存活率的重要因素之一。赵艳华等 [6]在包埋干燥超低温保存苹果离体茎尖时，发现茎尖的生理状态对存活率有非常