抗肿瘤反义寡核苷酸药物筛选和评价.pdf

抗箨●反．望寡攮营●羲■构●鼍秘弹价 英文麓写丧 抗肿瘤反义寡核苷酸药物的筛选和评价 硕士研究生t林 莉 指导老师。胡小电研究员 王升启研究员 中文摘要 ， f肿瘤分子生物学研究表明，肿瘤是由于基因异常引起的疾病。致病机 t 理包括癌基因的激活和抑癌基因的失活以及细胞周期的异常。肿瘤发病分 子机理的进一步阐明为肿瘤的基因治疗提供了可靠的理论依据。近年来肿 瘤研究的热点是肿瘤的发生与细胞周期，细胞增殖，细胞凋亡有密切关系。 APl4是凋亡抑制因子，它抑制细胞凋亡调节组织分化，促进突变发生和产 生治疗抗性而促进新生物中细胞的异常增殖而导致肿瘤发生。它抑制凋亡 的效力超过已发现的其它凋亡抑制因子家族成员。人类许多肿瘤如肺癌， 结肠癌，胰腺癌，前列腺癌，乳癌及50％的淋巴瘤均可出现较高表达。AjM．1 是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，参与染色体的分离，由于AIM．1过表达导致的 胞质分裂错误是肿瘤细胞染色体完整性受到干扰的重要因素。AIM．1蛋白 的基因在结直肠癌和其它肿瘤细胞中过表达，被认为与多核和倍性增加有 关。Plkl是一种丝氨酸／苏氨酸激酶，表达仅限于着丝粒和有丝分裂中期的 细胞，主要参与纺锤体的形成和染色体的分配。PlklmRNA的表达与细胞 的有丝分裂能力和肺癌病人的预后有关。细胞恶性增殖是发生癌变的基础。 IGFlR是调节哺乳动物细胞增殖的一种受体，在有丝分裂细胞生存，运动， 粘附中起重要作用。在人类大多数肿瘤中IGFlR表达增加，干扰IGFlR 的功能导致肿瘸细胞大量凋亡，抑制其生长，防止其转移。 反义技术是近十几年兴起的生物高技术，用反义技术封闭和抑制特定 2 中文摇 用互补寡聚核苷酸特异性抑制Rous肉瘤病毒的复制，首次提出了反义寡聚脱 碱基配对原理能够与mRNA的碱基对互补阻止其翻译成蛋白质的DNA。 反义寡核苷酸具有定向合理设计，体内外作用高效和能人工大规模合成等 药用特性，因而近年来成为治疗病毒感染，肿瘤，及其它由于基因表达异 常引起的疾病的一类潜在型药物，其中肿瘤相关基因可作为反义药物作用 的靶标。 过国际互联网引入RNAStructure3．2分析软件，选择RNA二级结构中膨 胀环，内环，发夹，多分支连接部等结构不稳定的区域作为反义药物设计 的靶位，每条基因设计了相应的8-9条反义寡核苷酸，并进行硫代修饰。将 染反义寡核苷酸，MTT(溴化噻唑蓝四唑)染色计算细胞增殖的抑制情况。 IGFI R2。前三条序列位于mRNA的5’端，IGFlR2序列位于mRNA的 0．06ttM，O．05pM，0．09pM和0．165pM。 为了寻找作用效果最好的反义药物，以上述序列为先导进行了优化，向 其5’和3’端移动几个碱基观察碱基的移动对细胞增殖抑制的影响。结果表 明向3’端移动3个碱基的APl4，。，Plkl。。两条序列的细胞增殖抑制活力高于 APl4，，Plkls序列而AIM-17IGFlR2序列优于优化的序列，从而从每个靶 基因的12条序列中筛选出了四条序列，它们的细胞增殖作用最强。 IGFl IGFlR2序列在细胞水平上的作用持续时间，结果表明在用药后的4天内细 胞增殖抑制率持续上升，第四天抑制率分别达到97％，95％，93％和90％的 峰值，至第5天开始缓慢下降，第六天降至82．4％，67．5％，78．3％和74．5％。 APl47l，AIM-17 细胞数为3x106个／只)裸鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作用，抑瘤率分别 无明显影响，无肉眼可见的毒性。瘤组织的病理切片表明，用药组瘤组织 大片坏死，组织间有纤维化，瘤周多为淋巴细胞浸润，而对照组以弥漫性 点状，片状坏死为主，瘤周炎细胞浸润以中性粒细胞和单核细胞为主。 为进一步明确ASODN的体内剂量依赖性关系。以三个不同剂量的 (12．Smg／kg／d，25mg／kg／d，SOmg／kg／d)IGFlR2腹腔注射观察药物对荷瘤裸 内具有良好的剂量依赖性关系，