人参皂苷合成相关βAS基因的克隆及其反义植物表达载体的建立.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（４）：７４～７７ 人参皂苷合成相关 ＡＳ基因的克隆 β 及其反义植物表达载体的建立  赵寿经　侯春喜 　梁彦龙　薛　健　王建华 （吉林大学生物与农业工程学院　长春　１３００２２） 摘要　以发根农杆菌Ａ４菌株诱导的人参发根为材料，用改良的异硫氰酸胍法提取总ＲＮＡ，得到 了纯度好的完整的总ＲＮＡ。利用ＲＴＰＣＲ扩增了 香树素合成酶基因，测序结果表明该目的片 ? β 段与ＧｅｎＢａｎｋ上的 香树素合成酶基因序列一致。这一基因重组入克隆载体ｐＭＤ１１９Ｔ，并转化 β ? 大肠杆菌。在此基础上，利用ｐＢＩ１２１质粒载体，构建了人参 香树素合成酶基因的反义植物表达 β 载体，为这一基因的反义调控研究打下基础。 关键词　人参　 香树素合成酶　反义植物表达载体 β 中图分类号　Ｑ７８６ 　　人参是珍贵的药用植物，由于具有显著的药理活 根［１１］，本室保存。 ［１～４］ 　　菌株和质粒：大肠杆菌 ＤＨ５，根癌农杆菌 性而得到十分广泛的应用 。人参的主要有效成分 α 为人参皂苷，至今已从人参中分离出至少６０种单体皂 ＬＢＡ４４０４，ｐＢＩ１２１植物双元表达载体均为本室保存。 ［５］ 　　试剂：高保真 ＲＴＰＣＲ试剂盒，ＤＮＡ扩增试剂盒， 苷，除Ｒｏ外，均为达玛烷型三帖皂苷 。由于受资源 ? 限制，从人参植物中获得人参皂苷的成本越来越高。 ＤＮＡＡＴａｉｌｉｎｇ试剂盒，ＤＮＡ胶回收试剂盒，ＤＮＡ连接 ? 通过改善人参皂苷生物合成效率，用遗传改良方法提 试剂盒均购自大连宝生物公司，异硫氰酸胍、青霉素、 高人参皂苷含量，是一项有意义的探索［６］。近年来发 卡那霉素购自北京鼎国生物公司，其余为国产分析纯。 展起来的反义 ＲＮＡ技术为调控生物合成途径关键酶 １．２　方　法 ［１２］ 基因活性，改变特定产物的代谢流，提供了有效的手 １．２．１　人参发根总ＲＮＡ提取　在常规方法 上作如 ［７］ 下改进：（１）减少样品的起始量，使之与提取缓冲液的 段 。 ［８］ 比例在 １∶１５左右；（２） 巯基乙醇浓度提高到 　　目前，人参皂苷生物合成途径已基本明确 。达 β 玛烷合成酶和 香树素合成酶（ＡＳ）是分别催化达玛 ０．３ｍｏｌ／Ｌ；（３）２０℃异丙醇沉淀 ＲＮＡ时加入与异丙 β β ? 烷型三萜皂苷和齐墩果烷型三萜皂苷合成的两个关键 醇等体积的３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ。总ＲＮＡ用１％琼脂糖凝胶 酶［９，１０］，我们试图通过建立 香树素合成酶基因的反 电泳检测。