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第十五章 核酸的研究方法 DNA的分离 RNA的分离 核酸的定量 通常很难分离出完整DNA分子，但可得到分子量不太大的环状DNA，这类制剂包括： 共价闭环DNA：常呈超螺旋型 开环DNA：双链环状DNA的一条链断裂，分子呈松弛态 线型DNA：环状DNA的双链断开 在超速离心机造成的离心力场中，溶液中的核酸下沉的速率会大大加快，这是核酸的沉降特性，该技术可研究： ? 核酸在溶液中的构象 ? 测定核酸的沉降系数和相对分子量 氯化铯密度梯度沉降平衡超离心法 核酸密度测定 测定DNA中G-C之含量 溶液中核酸构象的研究 用于核酸的制备 凝胶电泳兼有分子筛和电泳的双重效果 不纯核酸样品： 琼脂糖凝胶电泳分离出区带 溴化乙锭染色 紫外灯下粗略估计含量 电泳迁移率取决于： 核酸分子大小 胶浓度 DNA的构象 电流 碱基组成 温度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺作为支持物 孔径小于丙烯酰胺 可分析小于1000bp的DNA片断 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 PCR技术的基本原理 PCR反应成分： 1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸； 4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等。 PCR反应基本步骤： 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55℃，30s）。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（70～72℃，30～60s） 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。 PCR反应产物积累规律示意图 寡核苷酸的化学合成起步于20世纪四十年代末 1955年，剑桥大学的Todd实验室成功合成了具有磷酸二酯键结构的TpT,并获得1957年诺贝尔奖 1965年，Khorana等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一聚合物或二种、三种脱氧核苷的重复序列，人工合成的六十四种核糖三糖苷，研究蛋白质的生物合成过程，从而确定了氨基酸的三联密码子，因此而获得1968年诺贝尔奖 六十至七十年代，寡核苷酸的化学合成方法不断完善，逐渐形成了今天被广泛应用的固相亚磷酸三酯法并实现了合成的自动化 固相合成寡核苷酸 Routine process Microprocessor-controlled instrument Synthesis on a solid support First base(3’) attached to solid support Synthesis direction is 3’?5’ 经过化学修饰的核苷酸 3’位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基 3’位P上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去。 5’-DMT，保护基，缩合前脱去。 A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。 G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。 固相支持物 最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（CPG，controlled pore glass），CPG的孔径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小于60nt时，选择孔径500埃，链长大于60nt时，使用1000埃CPG，使用CPG的缩合效率高达98%-99.9%，可以满足合成长达175nt的寡核苷酸的条件。CPG通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合，核苷酸的5’羟基用二甲氧基三苯甲基（DMT）保护。 合成的具体步骤 去封闭,用三氯乙酸去除CPG所连核苷上的DMT,以暴露5’羟基，供下一步缩合。 活化,在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。 连接，亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。 盖帽,为了防止未反应的与CPG