猪呼吸道疾病综合征四种病原菌复合PCR方法建立应用.pdf

摘要 猪呼吸道疾病综合征(Porcine Disease RespiratouComplex，PI①C)是引起呼 吸系统症状的一类重要综合征的总称，近些年来，随着规模化养殖的迅速发展，临 床上出现了一种以呼吸道症状为主症的猪病，给养猪业造成巨大损失。研究表明， 副猪嗜血杆菌(砌P聊印办玎螂p口r傩甜西，HPS)、猪多杀性巴氏杆菌妒傩胞“坨如m础Dc 的流行情况还不完全清楚，同时此四种病原菌引起的临床症状较为相似，故难以从 临床症状上对其诊断，不利于准确快速鉴别诊断。鉴于此，在前期研究的基础上， 本研究旨在建立同步检测Mhp、ss、HPS、Pm的四重PCR方法，为临床快速鉴别 鉴定及其流行病学调查研究提供技术手段。为此，本研究开展了以下两方面的工作。 首先，建立了检测Mhp的单一PCR方法并优化可以同步检测Mhp、SS、HPS、 P36基因序列，应用软件设计合成特 Pm四种病原菌的复合PCR方法。根据Mhp 异性引物。通过优化确定了检测Mhp单一PCR方法的最佳反应体系和反应条件。 再通过序列分析、敏感性试验、特异性试验和重复性试验评估建立的单一PCR方 法。在单一PcR的基础上，首先寻找能检测四种病原菌的相同退火温度，然后采 用正交设计优化Taq 环数进行摸索，确定了四重PCR方法的最佳反应体系和反应条件。 然后，利用建立的四重PCR、单一PCR与常规细菌分离技术相结合的方法， 对分别采自安徽地区临床疑似PRDC发病猪、临床发病非PRDC猪以及临床假定健 康猪进行检测，并进行细菌分离。结果显示，总共分离细菌27株，其中ss18株， HPS 4株，Pm 6株，Mhp未做分离。四重PCR方法检测结果与单～PCR方法检测 结果差异不显著(P0．05)，且符合率为91．0％。安徽各地区猪场HPS存在较高带菌 同时阳性率为O％，且病原在分布上有区域差异性，不同生长阶段的猪群均可检出。 综上所述，本研究建立的四重PcR方法可以在3h鉴别出Mhp、ss、HPs和 Pm，且具有良好的特异性、灵敏性、稳定性和重复性，以及具有简便、快速与经济 的优势，实验研究结果表明，所建立的四重PCR方法可直接用于临床PRI)C四种 病原菌的鉴定，而且为安徽地区开展PRI)C流行病学调查提供了有效的技术手段。 关键词：猪肺炎支原体；猪链球菌；副猪嗜血杆菌；猪多杀性巴氏杆菌；四重PCR Abstract Porcine a te册of Respirato眄DiseaseComplex(PRDC)isgeneral important t0 whichrise the recent the syndromesgiVe respirat0叮symptoms．Inyears，witIlrapid deVe of swinediseaSe Iopmentla唱e-scale ch甜犹terized f．arming，a byrespirat0呵 hasbeen lossin that symptoms arisen，causinggreat swinepmduCtion．Studiesshow p甜asuiS consideredt0bethecommon of (HPS)andf切．，胞”坨肋肼甜缸Dcf如饵m)are pathogens PItDC．Sincethe