定向酶法制备活性肽分析系统研究.docVIP

目录 摘 要 I Abstract II 第一章 绪论 1 1.1 酶法制备活性肽研究现状 1 1.2 ACE抑制肽 2 1.3 ACE抑制肽的蛋白源 2 1.4 课题立题意义和主要内容 3 参考文献 4 第二章 数据库的建立以及分析系统软件的编写 8 2.1 前言 8 2.2系统设计 8 2.2.1 设计思想 8 2.2.2 硬件与软件配置 8 2.2.3 资料的收集与整理 9 2.2.4 系统的结构与功能 9 2.3 数据库系统的维护及扩充 10 2.4 软件功能使用实例 10 2.5 本章小结 15 参考文献 16 第三章 分析系统在实验中的应用 20 3.1前言 20 3.2 材料与方法 20 3.2.1 实验材料和主要试剂 20 3.2.2 主要仪器 20 3.2.3 实验方法 21 计算机分析：蛋白质筛选、蛋白质水解酶的筛选 使用见 2.4 21 水分含量测定 ：105℃恒重法 GB5497-85 21 粗蛋白含量测定：微量凯氏定氮法 GB5511-85 21 粗脂肪含量测定：索氏抽提法 GB5512-85 21 灰分含量测定：550℃灼烧法 GB5505-85 21 蛋白质水解物制备的的步骤 21 正交实验酶解优化条件 21 水解物冷冻干燥 21 水解度的测定 21 0 酶解产物的ACE抑制活性的体外检测 23 3.3 实验结果与讨论 23 3.3.1 ACE抑制肽底物蛋白的计算机筛选结果 23 3.3.2 原料成分分析 25 3.3.3 胰蛋白质水解酶水解小麦谷朊粉的结果分析 25 3.3.4 碱性蛋白质水解酶水解小麦谷朊粉的结果分析 26 3.3.5 水解物ACE抑制活性检测 27 3.4 本章小结 28 参考文献 29 第四章 ACE抑制肽的纯化与结构鉴定 30 4.1前言 30 4.2 材料与方法 30 4.2.1 实验材料与主要试剂 30 4.2.2 主要仪器 30 4.2.3 实验方法 31 Sephadex G-15分离纯化ACE抑制肽 31 RP-HPLC分离纯化ACE抑制肽 31 LC/MS鉴定ACE抑制肽氨基酸序列 31 ACE抑制活性的测定 31 4.3 结果与讨论 31 4.3.1 Sephadex G-15分离ACE抑制肽 31 不同样品浓度对Sephadex G-15分离ACE抑制肽效果的影响 32 洗脱液不同流速对Sephadex G-15分离ACE抑制肽效果的影响 32 Sephadex G-15分离蛋白质水解物所得不同组分的ACE抑制活性 34 4.3.2 半制备HPLC分离纯化ACE抑制肽 34 4.3.3 ACE抑制肽的氨基酸组成 35 4.4 本章小结 38 参考文献 39 结论 40 致谢 41 攻读硕士期间申请专利及发表的论文清单 42 论文创新点 43 摘 要 本课题首先利用Access XP数据库软件建立了蛋白质数据库、活性肽数据库、蛋白质水解酶数据库，利用VB编写“定向酶解制备活性肽分析系统”程序。蛋白质数据库中包含常见的食物蛋白质的一级序列、链长、分子量等信息；活性肽数据库包含活性肽的功能、氨基酸序列、PI参考文献等信息；蛋白质水解酶数据库包含蛋白质水解酶的酶切位点、参考文献等信息。数据库与 “定向酶法制备活性肽分析系统”程序配合，实现活性肽在蛋白质中搜寻并给出活性肽在蛋白质中的含量，实现蛋白质用单酶或者复酶的模拟水解等功能。 本课题在利用“定向酶解制备活性肽分析系统”分析常见食物蛋白中ACE抑制肽含量的基础上，选定小麦蛋白质作为ACE抑制肽的蛋白源。通过分析活性肽数据库中ACE抑制肽的结构特点并结合蛋白质水解酶的作用位点，模拟水解小麦蛋白质。模拟水解结果显示，碱性蛋白质水解酶更适合制备ACE抑制肽，实验同时选用胰蛋白质水解酶作为比较。 通过分析数据库以及正交试验筛选出碱性蛋白质水解酶作为小麦蛋白质的水解酶，并确定优化条件：酶用量22.5μL/g，pH值9.5，温度60℃/MS鉴定，从小麦蛋白质Alcalase水解物中分别鉴定出一种新的ACE抑制肽PLY，其IC50值为15.3 μM，小麦蛋白中有354条一级序列包含PLY片断，PLY符合ACE抑制肽的规律。 论文通过实验初步验证了“定向酶法制备活性肽分析系统”可行性。 关键词：数据库，生物活性肽，蛋白质序列，活性肽序列，蛋白质水解酶，血管紧张素转化酶抑制肽，Alcalase蛋白质水解酶 Abstract Firstly, the paper makes use of MS Access to set up protein database, active peptides database and proteolytic enzyme