假单胞菌M18中PCA合成酶作用比较研究.pdf

假单胞菌 M18 中PCA 合成酶的作用比较研究 摘要 吩嗪-1-羧酸（PCA）是假单胞菌的一种重要次生代谢物,具有广谱 的抗真菌生物活性。假单胞菌主要通过莽草酸途径来生物合成PCA，由 phz 基因簇来控制，该基因簇由 phzA、B、C、D、E、F、G 7 个基因组成， 其中何者对合成途径影响最为关键目前还未见报道。有实验表明，PhzA、 PhzB 并不是合成途径不可或缺的，PhzC 蛋白下游的产物分枝酸水平与 PCA 积累没有直接相关，所以推断另外四个酶更为关键。本实验选取 phzD、phzE、phzF、phzG 四个基因为研究对象，利用基因过表达、反义 RNA 等技术，进行假单胞菌中PCA 合成酶的作用比较研究。选取的假单 胞菌株M18，是本实验室筛选出的PCA 高产菌株，是首次确认可以同时 生产PCA 和藤黄绿菌素（Plt）两种抗生素的功能菌株。 实验中分别构建 phzD、phzE、phzF、phzG 基因过表达功能质粒， phzD 转化假单胞菌株M18，经过对比发酵实验，结果显示在四种基因中， 基因过表达菌株对PCA生物合成具有最显著的影响，与空质粒参照对比， PCA 产量可以提高 30%以上，其他几个基因过表达的影响并不显著。于 是可以推断，在单个 phz 基因的作用时，phzD 基因对假单胞菌株生物合 成PCA 具有最大的作用。而通过接种时间和摇床转速等反应条件的比较 试验，结果表明，在野生株和 phzD 基因过表达菌株之间，发酵生产PCA 的条件存在一些差异。利用反义 RNA 技术的抑制作用，观察在 phzD 基 phzD 基因反义RNA 的抑 因表达受到阻碍时的PCA 发酵产量，结果表明， 制显著降低了假单胞菌M18 生物合成PCA 水平。 关键词：假单胞菌M18，PCA，phz 基因簇，基因过表达，反义RNA Comparative Functional Study of PCA Synthases in Pseudomonas sp. M18 Abstract Phenzine-1-carboxamide is a secondary metabolite produced by some strains of Pseudomonas and a kind of biologically active antifungal agents. The PCA biosynthesis is mainly by Shikimate pathway. It was commonly accepted that the phenazine biosynthetic gene cluster in Pseudomonas contains seven genes, but until now it has been unknown exactly which one functions the most significantly in the pathway. The evidenced result was that phzA/B/C cannot be the key one. PhzA and PhzB were not surposed necessary and the level of chorismic acid that is on the down-stream of PhzC cannot influence PCA directly. In this study we selected phzD, phzE, phzF and phzG as candidates to approach and analyze the r