基因枪法将Bhlea2基因导入玉米初步与研究.docVIP

基因枪法将Bhlea2基因导入玉米的初步研究 摘要：构建了牛耳草（ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ）胚胎发育晚期丰富蛋白基因（ｂｈｌｅａ２）的植物表达载体ｐｙｌ１，以玉米（ｚｅａ ｍａｙｓ ｌ．）自交系５０１的愈伤组织为受体，利用基因枪法将ｂｈｌｅａ２基因导入，获得５１株抗性植株，经ｐｃｒ检测有１０株阳性植株，阳性率为１９．６％，初步证明外源基因已整合到玉米基因组中。 关键词：玉米（ｚｅａ ｍａｙｓ）；愈伤组织；ｂｈｌｅａ２基因；基因枪法 ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｚｏｕ ｌｕ－ｌｉｎ１，２，ｗｅｉ ｊｉａｎ－ｈｕａ２，ｚｈａｎｇ ｓｈａｏ－ｂｉｎ１，ｗａｎｇ ｈｏｎｇ－ｚｈｉ２ （１． ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｌｌｅｇｅ， ｓｈｅｎｙａｎｇ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， ｃｈｉｎａ； ２． ｂｅｉｊｉｎｇ ａｇｒｏ－ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｅｎｔｅｒ， ｂｅｉｊｉｎｇ ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｏｒｅｓｔｒｙ ｓｃｉｅｎｃｅ， ｂｅｉｊｉｎｇ １０００９７， ｃｈｉｎａ） ａｂｓｔｒａｃｔ： ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐｙｌ１ ｏｆ ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． ｔｈｅ ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ（ｚｅａ ｍａｙｓ） ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ ５０１ ｂｙ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ． ５１ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ １０ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ｐｃｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １９．６％， ｉｔ ｗａｓ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ ｇｅｎｅ ｈａd ｂｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ（ｚｅａ ｍａｙｓ）； ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ； ｂｈｌｅａ２ ｇｅｎｅ； ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ 玉米（ｚｅａ ｍａｙｓ ｌ．）是全球最重要的粮、经、饲三元作物，我国玉米的总产量仅次于水稻，占世界总产量的２０％左右，同时，我国也是玉米的第一消费大国［１］。然而，由于气候、地理以及玉米自身的水分生理状况等原因，干旱已成为限制玉米高产稳产的主要非生物胁迫因素之一［２－８］。目前，通过转基因手段培育耐旱品种，改良玉米干旱胁迫耐受性是最为有效的途径之一［９，１０］。 胚胎发育晚期丰富蛋白（ｌｅａ蛋白）是一类高度亲水的小分子蛋白质，在植物和动物中广泛分布，大多与细胞脱水过程密切相关。很多ｌｅａ蛋白在成熟的种子中积累，在种子萌发后迅速消失。ｂｈｌｅａ２基因是复苏植物苦苣苔科旋蒴苣苔属植物牛耳草（ｂｏｅａ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃａ （ｂｕｎｇｅ） ｒ ｂｒ．）中ｌｅａ蛋白的编码基因，在烟草中过量表达可显著提高转基因烟草的耐旱性［１１－１６］。目前，基因枪介导的转基因方法较为完善［１７］，本研究利用基因枪法将耐旱基因ｂｈｌｅａ２导入玉米的愈伤组织，为提高玉米耐旱性的研究奠定基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料与试剂 供试品种为玉米自交系５０１（京玉７号－５０１／京２４的亲本之一），供试原始质粒载体为ｐｂｉｎ１９－ｂｈｌｅａ２、ｐｕｂｉ－ｂａｒ和ｐｂｐｃ２６，由北京农业生物技术研究中心保存。 限制性内切酶、ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、ｉｐｔｇ、ｘ－ｇａｌ等购自大连宝生物工程有限公司（ｔａｋａｒａ）；高保真ｔａｑ酶和ｋｏｄ酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；ｐｇｅｍｒ－ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ、ｔ４ ｄｎａ连接酶购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、ｄｎａ凝胶回收试剂盒、基因组ｄｎａ提取试剂盒及ｄｎａ电泳ｍａｒｋｅｒ购自天根生化科技（北京）有限公司和北京全式金生物技术有限公司；氨苄青霉素购自北京奥赛博科技发展有限公司。 诱导、继代培养基：ｎ６基本培养基＋１００ ｍｇ／ｌ肌醇＋２ ｍｇ／ｌ ２，４－ｄ＋１０ ｍｇ／ｌ ａｇｎｏ３＋３０ ｇ／ｌ蔗糖＋４ ｇ／ｌ ｐｈｙｔａｇｅｌ；筛选培养基：诱导培养基＋２ ｍｇ／ｌ ｂａｒ；分化培养基：ｎ６基本培养基＋１００ ｍ